بخشی از مقاله
چکیده
تنوع ژنتیکی 23 جدایه قارچ F. solani با استفاده از نشانگرISS بررسی و نتایج با گروههاي سازگار رویشی جدایهها مقایسه شد. بعد از استخراج DNA قارچ و انجام PCR، به کمک آغازگرهاي ISS باندهاي واضح در تصاویر ژل مشخص شدند. 81 باند قابل رتبهبندي در دامنه3000 -350 جفت باز در 23 جدایه مورد بررسی تکثیر شد. از 10 جایگاه شناسایی شده توسط این آغازگر، در 9 جایگاه چندشکلی مشاهده شد.
بهترین روش گروهبندي با ضریب جاکارد و روش تجزیه خوشهاي UPGMA مشخص شد. برش دندروگرام در سطح تشابه %88 جدایهها را به 12 گروه تقسیم کرد که از a تا l نامگذاري شدند. گروههاي c و e هر کدام دو عضوي، گروه d سه عضوي، گروه f چهارعضوي، گروه h پنج عضوي و بقیه تکعضوي بودند. نتایج این بررسی، آزمون VCG جدایهها را که قبلا انجام شده بود، تا حدي تایید کرد ولی با مناطق جغرافیایی محل جمعآوري جدایهها ارتباطی یافت نشد. همچنین این نشانگر نتوانست بخوبی تفاوت بین جدایهها را مشخص کند و تنوع ژنتیکی پایینی از این قارچ نشان داد.
مقدمه :
گوجه فرنگی زراعی - Lycopersicon esculentum Mill. - ، یکی از محصولاتی است که اخیرا به لیست محصولات غذایی جهان اضافه شده است و در طی قرن گذشته با تولید سالانهي حدود 50 میلیون تن، یکی از محبوب ترین سبزيها محسوب میگردد
از گونههاي جنس فوزاریوم که باعث پوسیدگی طوقه و ریشهي گوجهفرنگی میشود، قارچ Fusarium solani - Martius - Appel & Wollenweber emend. Snyder & Hansen که مرحلهي جنسی آن Haemanecteria haematococca - Barkeley & Broome - Samuels & Nirenberg. - Nectria haematococca. - است .
پوسیدگی طوقه و ریشهي گوجهفرنگی ناشی از F.solani اولین بار در سال 1988 و از Central Queensland استرالیا توسط واودري1 و پترسون2 گزارش شده است. در سال 1386 این قارچ براي اولین بار از ایران به عنوان عامل پوسیدگی طوقه و ریشه گوجهفرنگی گزارش شد
پس مطالعات درباره جدایههاي این قارچ از گیاه گوجهفرنگی در ایران در حد جداسازي، شناسایی و اثبات بیماريزایی بوده است و در دنیا به جز مطالعهاي که توسط رامبرگ و دیویس - 5 - صورت گرفته و تنها چند جدایه از این قارچ براي VCG و کار مولکولی استفاده شده، مطالعهاي از طریق VCG و کار مولکولی روي آن صورت نگرفته است. در دنیا استفاده از نشانگر ISS در مطالعهي حاضر درباره تنوع ژنتیکی F. solani عامل پوسیدگی طوقه و ریشه گوجهفرنگی براي اولین بار انجام شده است.
بقایی راوري و همکاران در سال 1385 با استفاده از نشانگرهاي ISS، ISSR و RAPD تنوع ژنتیکی جدایههاي F. solani عامل پژمردگی و پوسیدگی خشک فوزاریومی سیب زمینی در استانهاي خراسان شمالی و رضوي بررسی کردند. در این بررسی، برش دندروگرام در سطح %75 جدایهها را در ISSR به 18گروه، در ISS به 22 گروه و در RAPD به 16گروه تقسیم کرد که نشاندهنده کارایی بیشتر نشانگر مطالعه حاضر در تفکیک جدایهها نسبت به RAPD است.
در این بررسی از 28 جدایه مورد مطالعه، 6 جدایه VCG آنها مشخص بود که نتایج تجزیه کلاستر حاصل از RAPD و ISSR یافتههاي حاصل از VCG را تایید کرد ولی نشانگر ISS دو جدایه با VCG یکسان را از هم تفکیک کرد. همچنین در این تحقیق تجزیه دندروگرام هر یک از نشانگرها، جدایهها را بدون توجه به منشا جغرافیایی در گروههاي ژنوتیپی مختلفی قرار داد
اساس روش ISS تفاوت اینترونهاي درون ژنهاي کدکننده زیرواحدهاي ریبوزومی است. اینترونها به چهار گروه اصلی شامل گروهI، گروهII، گروه mRNA و tRNA با توجه به سازوکارهاي پیرایش تقسیم میشوند
حضور یا عدم حضور اینترون گروهI در DNA کدکننده RNA ریبوزومی، باعث چندشکلی طولی در انتهاي3′ زیرواحد کوچک rDNA جدایههاي F. solani می شود. از این روش در حل اختلافات و سردرگمی روابط خویشاوندي گونههاي قارچی از جمله F. solani نیز استفاده شده و بدینوسیله چندشکلی قابل توجهی بین گونههاي مختلف جنس فوزاریوم شناسایی شده است
با توجه به اهمیت گوجهفرنگی در ایران و جهان و خسارت ناشی از این بیماري مطالعه روي قارچ عامل بیماري ضروري به نظر میرسد. هدف از انجام این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی جدایههاي قارچ F.solani عامل پوسیدگی طوقه وریشه گوجهفرنگی در استان خوزستان با استفاده از نشانگر ISS و ارتباط آن با VCG و بیماريزایی ومناطق جغرافیایی محل جمعآوري جدایهها میباشد.
مواد و روشها :
جداسازي و شناسایی : بعد از جمعآوري گیاهان آلوده گوجهفرنگی از شهرهاي مختلف خوزستان، جداسازي قارچ از ریشههایی که علائم بیماري را نشان میدادند، با استفاده از محیط کشت انتخابی Nash & Snyder صورت گرفت. بعد از خالصسازي جدایهها، شناسایی جدایهها روي محیط کشت برگ میخک- آگار - CLA - و محیط کشت PDA انجام گرفت.
تعیین گروههاي سازگار رویشی و آزمون بیماريزایی جدایهها : گروههاي سازگار رویشی - VCG - بدینصورت انجام گرفته بود که از محیط کشت زاپک-کلرات %6 حاوي رزبنگال براي تولید موتانتهاي نیت استفاده شد. بعد از تعیین کلاس فنوتیپی موتانتهاي نیت مختلف، مکملسازي بین موتانتهاي نیت جدایههاي مختلف صورت گرفت و گروههاي سازگار رویشی جدایه هاي مختلف تعیین شد. بیماريزایی جدایهها نیز طی آزمون بیماريزایی به اثبات رسید.
بررسی تنوع ژنتیکی جدایهها با استفاده از نشانگر : ISS براي اینکار استخراج DNA قارچ مطابق روش ویلند - 8 - صورت گرفت. آغازگر ISS با توالی 5′-CTGGCTTGGTGTATGT-3′ - تهیه شده از شرکت سیناژن - براي شناسایی جدایه هاي همکلون استفاده شد. تکثیر DNA مطابق روش برسیلیرو و همکاران - 3 - در واکنش 25 میکرولیتري شامل 2/5 میکرولیتر بافر 20 - PCR 10X میلی مولار Tris-HCl با PH=8، 50 میلیمولار KCl - ، 2 میلیمولار MgCl2، 0/25 میلی مولار مخلوط dNTPs، 25 پیکو مول آغازگر، 50 نانوگرم DNA ژنومی و 1/25 واحد آنزیم تکپلی مراز انجام شد. تکثیر با برنامه حرارتی 3 دقیقه در 94 درجهسانتیگراد، 40 سیکل با 1 دقیقه در 94 درجهسانتیگراد، 2 دقیقه در 45 درجهسانتیگراد، 90 ثانیه در 74 درجهسانتیگراد و مرحله توسعه نهایی با 5 دقیقه در 72 درجهسانتیگراد انجام شد. در یک واکنش به جاي DNA ژنومی از آب مقطر سترون براي کنترل آلودگی استفاده گردید.
سپس کمیت و کیفیت DNA استخراجی تعیین گردید و به منظور رنگ آمیزي ژل از DNA Safe Stain - شرکت سیناژن - استفاده گردید. انجام الکتروفورز با استفاده از آگارز 1 درصد و طی زمان 2 ساعت انجام و در نهایت تصاویري از باندهاي ایجاد شده تهیه شد.
باندهاي واضح در تصاویر ژلها مشخص گردید. دادهها پس از انتقال به برنامه excel بصورت کدهاي یک و صفر معرف حضور و عدم حضور باندها تبدیل شدند و ماتریس دادههاي یک و صفر تهیه گردید. تنها باندهاي تکرار پذیر جهت آنالیز انتخاب شدند که چندشکلی نشان داده بودند و مکانهاي یکشکل حذف شدند. در این تحقیق توسط نرم افزار NTSYSpc 2.02 ماتریس تشابه بین جفت جدایه ها از ضرایب تشابه دایس، جاکارد، تطابق ساده - SM - و K1 محاسبه و از سه روش خوشه بندي UPGMA، SINGLE Linkage و COMPLETE Linkage استفاده گردید.
نتایج و بحث :
79 جدایه جداسازي شده در آزمایشات قبلی که در20 گروه VCG قرار گرفته بودند 13 گروه آنها تکعضوي بودند و 9 جدایه خودناسازگار تشخیص داده شدند . 23 جدایه از آنها بدینشکل انتخاب شد که 4 جدایه از گروههاي تکعضو و 3 جدایه خودناسازگار از شهرهاي مختلف و 16 جدایه از گروههاي مختلف چند عضوي و از شهرهاي مختلف براي کار مولکولی و بیماري زایی انتخاب شدند. با استفاده از آغازگر ISS، 81 باند قابل رتبهبندي در دامنه3000 -350 جفت باز در 23 جدایه مورد بررسی تکثیر شد. از 10 جایگاه شناسایی شده توسط این آغازگر، در 9 جایگاه چندشکلی مشاهده شد.
با توجه به اینکه که براي گروهبندي جدایهها از ضرایب و روشهاي مختلف خوشهبندي استفاده شده بود، بهترین گروهبندي با ضریب تشابه جاکارد و روش تجزیه خوشهاي UPGMA انتخاب شد. ضریب تشابه بین جفت جدایهها از صفر تا یک متغیر بود. حداقل تشابه بین جدایه 66 با سایر جدایهها و با ضریب تشابه صفر بود. حداکثر تشابه بین جدایههاي 53 و 79، 67و3و38، 13و47، 20 و26 و 9 و 60، 5و59و24و8و32 با ضریب تشابه یک بود. برش دندروگرام در سطح تشابه %88 جدایهها را به 12 گروه تقسیم کرد که از a تا l نامگذاري شدند. گروههاي c و e هر کدام دو عضوي، گروه d سه عضوي، گروه f چهارعضوي، گروه h پنج عضوي و بقیه تکعضوي بودند.
مقایسه نتایج تجزیه خوشهاي جدایهها با نشانگر ISS و VCG و مناطق جغرافیایی : در گروهبندي ایجاد شده از نشانگر ISS، گروه a شامل جدایهاي خودناسازگار بود که توسط این نشانگر از سایر جدایهها تفکیک شد. گروه b نیز تکعضو و متعلق به یک گروه VCG تکعضو بود. گروه d شامل دو جدایه از چهار جدایه VCG6 و یک جدایه خودناسازگار بود. گروه e شامل دو جدایهي VCG5 بود که از سایر جدایهها تفکیک شد. گروه f شامل دو جدایه VCG7 و دو جدایه از VCGهاي مختلف بود. گروه h شامل دو جدایهي VCG2 و جدایههاي دیگري بود.
گروههاي j و k که متعلق به یک گروه VCG هستند، با این که در سطح %88 در یک گروه قرار نمیگیرند ولی کمی دورتر در سطح %60 به هم میرسند و یک گروه را تشکیل میدهند. بنابراین اینجا نیز تا حدي گروهبندي جدایهها براساس VCG را تایید میکند. بقیه گروهها مطابقتی با VCG نداشتند. پس یافتههاي حاصل از این نشانگر تا حدي نتایج تعیین تنوع ژنتیکی جدایهها با استفاده از VCG را تایید میکند. اما ارتباطی بین نتایج این نشانگر و گروهبندي بیماريزایی جدایهها و همینطور با مناطق جغرافیایی محل جمعآوري آنها مشاهده نشد.
همانطوري که در این تحقیق مشاهده میشود گروهبندي ISS تا حدي با گروهبندي ژنتیکی جدایهها با استفاده از VCG مطابقت دارد. بنابراین این نشانگر توانست بخشی از تنوع را نشان دهند. از جمله دلایل این امر آن است که این نشانگرکل ژنوم را پوشش نمیدهند یعنی براي اینکه ما مطابقت بیشتري با VCG ببینیم باید تعداد آغازگرها را افزایش دهیم. پس به احتمال زیاد افزایش تعداد آغازگرها و افزایش تعداد جدایه ها قادر به حل این موضوع میباشد. بنابراین به نظر میرسد استفاده از نشانگرهایی همانند AFLP، SSR ،RFLP ، SNP و SCAR میتواند در بررسی تکمیلی تنوع ژنتیکی این قارچ و گروه بندي دقیقتر آن موثر باشند.
عدم ارتباط بین بیماريزایی جدایهها و تنوع ژنتیکی آنها با استفاده از این آغازگر در این تحقیق و تحقیقات مشابه را میتوان به همین دلیل دانست زیرا ممکن است نواحی از ژنوم قارچ تکثیر پیدا کند که ارتباطی با ژن بیماريزایی نداشته باشد. همانطوري که دیده شد این نشانگر توانست تا حدي تفاوت بین جدایهها را نشان دهد و نتایج این تحقیق تنوع ژنتیکی پایینی از این گونه را نشان داد یعنی مناطقی که نشانگر تکثیر کرده تنوع پایینی داشته است.
