بخشی از مقاله
چکیده:
در این پژوهش بهینه سازي تولید عامل بیولوژیک - باکتري - Bacillus thuringiensis از دو جدایه بومی KH4 و YD5 بصورت کشت غیر مداوم درون بیوراکتور مخزنی همزندار مورد بررسی قرار گرفت. در این طرح از ساکارز و نشاسته هیدرولیز شده به عنوان منبع کربن، کورن استیپ به عنوان منبع ازت و نمک دریا به عنوان منبع تامین املاح در بستر کشت درون فرمانتور استفاده گردید و تاثیر فاکتورهاي محیطی از قبیل pH، میزان تلقیح اولیه و غلظت اکسیژن بر سینتیک رشد، تولید اسپور و اندوتوکسین مورد بررسی قرار گرفتند. در بررسی pH بهینه در دامنه 6/5-7/5 مشخص شد که pH بهینه براي دو سویه KH4 و YD5 به ترتیب برابر 6/5 و 7 میباشد و در میزان تلقیح اولیه 2 درصد، بیشترین میزان تولید اسپور و اندوتوکسین حاصل شد و افزایش میزان تلقیح تا سطح 3 درصد، تاثیر معنیداري بر تولید اسپور و کریستال نهایی نداشت.
در بررسی غلظت اپتیمم اکسیژن محیط کشت در دامنه 50-90 درصد اشباع نیز مشخص شد که بهترین غلظت اکسیژن براي سویههاي KH4 و YD5 به ترتیب برابر با 70 و 90 درصد اکسیژن بوده و حضور اکسیژن هنگام تولید اسپور و کریستال ضروري است. نهایتاً پس ازبهینهسازي محیط کشت و شرایط فیزیکی رشد هر دو سویه میزان اسپور و اندوتوکسین نهایی تولید شده برابر6/2 × 109 اسپور - CFU/ml - و 813 میلیگرم پروتئین در میلیلیتر براي سویه KH4 و 5/5 × 109 اسپور - CFU/ml - و 740 میلیگرم پروتئین در میلیلیتر براي سویه YD5 بدست آمد.
مقدمه:
باکتري - Bt - Bacillus thuringiensis از خانوادهي Bacillaceae و یک باکتري گرم مثبت و اسپورزا است که در مرحلهي اسپورزایی، پروتئینهاي کریستالی حاوي دلتااندوتوکسینهاي حشرهکش تولید مینماید. سموم تجاري حاصل از این باکتري کارایی سموم شیمیایی را داشته و علاوه بر آن بدلیل اختصاصیت بالاي آنها بدلیل تولید سموم پروتئینی کریستالی - Cry - بر آفات خاص، داراي مزیت ایمنی زیست محیطی نیز هستند. در حال حاضر سموم حاصل از این باکتري عمده ترین سموم بیولوژیک مورد کاربرد در جهان - بیش از - %80 را شامل می شوند.
با توجه به اهمیت موضوع و ضرورت دستیابی به سویههاي برتر بومی، پس از دستیابی به بهترین سویههاي بومی باکتري Bt از لحاظ قدرت کشندگی و میزان ویرولانسی در پروژههاي تحقیقاتی پیشین - 1، - 2 توسعه محیط کشت و سیستم کشت مقرون به صرفه جهت تولید تجاري این محصول در کشور مورد بررسی قرار گرفت. در سالهاي اخیر تحقیقات مختلفی در زمینه یافتن محیطهاي کشت ارزان قیمت و قابل دسترس جهت تولید سویههاي Bt به عنوان سم بیولوژیک صورت گرفته است که با توجه به دسترسی به منابع کربن و ازت موجود در منطقه مورد نظر جهت تولید تجاري در همان منطقه مناسب بوده و موفقیت فرمولاسیونهاي ارایه شده وابستگی زیادي به شرایط منطقهاي دارد.
بنابراین با توجه ضرورت توسعه سیستم کشت اقتصادي جهت سوبههاي بومی و دسترسی به منابع ارزان قیمت کربن، ازت و املاح در کشور، در این پژوهش از پسابهاي صنعتی و ضایعات کشاورزي ارزان قیمت و در دسترس براي تکثیرو تولید عامل کنترل بیولوژیک از این باکتري استفاده و منابع مناسب جهت هر سویه بررسی شدهاند. همچنین شرایط کشت درون فرمانتور مانند دما، pH، درصد تلقیح، غلظت اکسیژن تاثیر بسزایی بر میزان تولید اسپور و کریستال دارند و در مطالعات متعددي مورد بررسی قرار گرفتهاند - 11،10،9،8،7، - 6 در این تحقیق نیز سعی شده است تا با استفاده از نتایج بهینه سازي محیط رشد و منابع غذایی تامین کننده کربن، ازت و املاح براي دو جدایه بومی KH4 و YD5، بهینهسازي شرایط کشت درون فرمانتور، سیستم کشت مناسب جهت تولید تجاري این دو جدایه بومی معرفی گردد.
مواد و روشها
سویهها و محیط کشت:
2 سویه بومی Bt ایران شامل KH4 - موثر بر سخت بالپوشان - و YD5 - موثر بر آفات پروانهاي - جداسازي و شناسایی شدند - 13، - 12 و توسعه محیط کشت اقتصادي جهت تولید انبوه این دو سویه مورد بررسی قرار گرفته است - . - 14 همچنین، به منظور بهینه سازي منبع کربن، ازت و مواد معدنی، از کربوهیدراتهاي گلوکز - به عنوان شاهد - ، نشاسته هیدرولیز شده1، ملاس - ساکارز - و پرمیت اولترافیلتراسیون شیر - لاکتوز - به عنوان منابع کربن و عصاره مخمر و آب استیپ ذرتCorn - 2 - steep به عنوان منابع ازت استفاده شد و براساس نتایج پژوهش پیشین مشخص شده که ترکیب نشاسته هیدرولیز شده 3 - درصد - ، آب استیپ ذرت 3 - درصد حجمی - و نمک دریا با رقت 4 برابر براي سویه YD5 و ترکیب ملاس 2 - درصد ساکارز - ، آب استیپ ذرت - 3 درصد حجمی - و نمک دریا براي جدایهKH4 منابع ارزان قیمت و موثري براي دست یابی به مقادیر بالایی از اسپور-کریستال باکتريها میباشند - . - 14 بر این اساس، دو ترکیب ذکر شده جهت کشت در مراحل پیش کشت و کشت نهایی مورد استفاده قرار گرفتند.
آماده سازي محیط کشت جهت کشت در فرمانتور
به منظور آماده سازي محیط کشت سویه YD5، ابتدا pH محلول نشاسته و املاح به 2 رسانیده شد و پس از چند دقیقه هم زدن به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو در دماي 121 درجه سلسیوس قرار داده شد تا نشاسته کاملا حل گردد. پس از اتوکلاو، pH محیط کشت درون مخزن راکتور به صورت اتوماتیک روي 7 تنظیم گردید و آب استیپ ذرت استریل 121 °C - ، 15 دقیقه - نیز به صورت استریل اضافه شد. براي تهیه محیط کشت سویه KH4 نیز ملاس - رقیق و املاح گیري شده - و آب استیپ ذرت با یکدیگر ترکیب شده و تنها نمک دریا به طور مجزا در اسیدیته 2 حل شده ودر نهایت به ترکیب اضافه میگردید. در نهایت pH نهایی به6/5 رسانده شد.
تهیه مایه تلقیح جهت کشت درون فرمانتور
براي هر فرمانتاسیون، به منظور تهیه کشت فعال 1 میلیلیتر از کشت نگهداري شده در سرما - -80°C - به 5 میلیلیتر محیط کشت مایع اضافه شده و به مدت 10-12 ساعت در دماي اپتیمم - 30 °C - انکوبه شد. سپس 1/5 میلیلیتر از کشت فعال به 150 میلیلیتر محیط کشت تلقیح اضافه گردید. جهت کشت تلقیح هر فرمانتاسیون از محیط کشت یکسان با محیط کشت اصلی فرمانتاسیون استفاده شد و به مدت 12 ساعت در گرمخانه همزندار - بیو-شیکر3، مدل BR-3000LF، ژاپن - با دماي 28°C و سرعت چرخشی 200 دور بر دقیقه نگهداري شد.
شرایط فرمانتور
کلیه فرمانتاسیونهاي انجام شده جهت بررسی تاثیر پارامترهاي رشد به حجم 1/5 لیتر، درون فرمانتور 2 لیتري BIOFLO - - 2000, Newbruwnswick Scientific, USA بصورت غیر مداوم ، هوازي و با 3 بار تکرار انجام شدند. جهت تلقیح فرمانتاسیون 15، 30 و 45 میلیلیتر - درصدهاي مختلف - از محیط کشت تلقیح به محیط درون فرمانتور - حجم نهایی 1/5 لیتر - اضافه شد. فرمانتاسیون براي هر دو سویه در دماي بهینه رشد 30˚C و pH هاي مختلف 6/5 - ، 7 و - 7/5، درصد تلقیح - 1-3 درصد - و میزان اکسیژن مختلف 50، 70 و 90 درصد اشباع انجام شد.
جهت تنظیم درصد غلظت اکسیژن از کنترل اتوماتیک دور همزن فرمانتور در محدوده 300-1200 دور در دقیقه و سرعت هوادهی 1 VVM استفاده شد و به منظور کنترل pH نیز از افزودن اتوماتیک محلولهاي 2 نرمال اسید کلریدریک و سود استفاده گردید. نمونه برداري نیز به صورت استریل و در ساعت هاي 48 - 24 -20 -16-12-8-6-4-2 و 72 انجام شد. در نهایت نمونهها 10 - میلیلیتر - در دماي -20˚C درون فریزر جهت آنالیزهاي بعدي نگهداري شدند. نهایتاً تاثیر عوامل ذکر شده بر سینتیک رشدو تولید اسپورو کریستال و اندونوکسین هردو سویه مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی سینتیک رشد، تولید اسپور و کریستال - اندوتوکسین -
به منظور مشاهده اجسام کریستالی و نوع آنها در سویههاي جداسازي شده با استفاده از روش ذکر شده در پژوهش پیشین انجام پذیرفت - - 14 و مشاهده میکروسکوپی نمونهها در هر مرحله رشدي از کینتیک رشد باکتري، پس از رنگ آمیزي گرم توسط میکروسکوپ صورت میگرفت تا مرحله سلولی و اسپور کریستال از یکدیگر تفکیک گردد.
ارزیابی کینتیک رشد براساس Online OD در فرمانتور و تعیین تعداد اسپور و میزان دلتااندوتوکسین
جهت ارزیابی سینتیک رشد در فرمانتور از اندازه گیري پیوسته و همزمان OD660 محیط کشت بوسیله سنسور کدورت سنج مجهز به فیبر نوري - Turbidity transmitter, Trb 8300, Mettler-toledo - که درون محفظه بیوراکتور قرار داده شد، استفاده گردید. جهت تعیین میزان اسپور از روش CFU استفاده شد - . - 14 پس از پایان مدت انکوباسیون، تعداد کلنی تشکیل شده شمارش و میزان تولید اسپور بصورت CFU گزارش گردید. همچنین جهت تعیین میزان تولید دلتااندوتوکسین از روش ذکر شده در پژوهش پیشین استفاده گردید - - 14، در نهایت میزان پروتئین کل سوپرناتانت بوسیله معرف برادفورد و روش برادفورد اندازهگیري شد - . - 15
نتایج و بحث
بررسی درصد تلقیح و pH بهینه
نتایج نشان دادندکه در مورد هر دو سویه با افزایش درصد تلقیح، فاز تاخیري رشد کاهش یافته و میزان رشد افزایش پیدا کرد. علاوه براین در مورد هر دو سویه، افزایش میزان مایه تلقیح از 2 به 3 درصد باعث تاثیر مثبت ناچیزي در رشد شده است . - P ≤0/05 - میزان رشد - - OD پس از 24 ساعت در میزان تلقیح 1، 2 و3 درصد در سویه YD5 به ترتیب برابر با 5/08، 5/89 و 5/93 و در 3/79 KH4، 7/22 و7/57 بود.
