بخشی از مقاله
بررسي ، جداسازي و شناسايي باکتري گونه Bacillus amyloliquefaciens از خاک با استفاده از ژن S rRNA١٦
چکيده
خاک حاوي هزاران گونه ميکروارگانيسم از جمله باکتريها ميباشد. گونه هاي جنس Bacillus در توليد آنزيم هاي صنعتي، توسعه عطر کاکائو، قهوه ، وانيل ، توليد فيبرهاي طبيعي، غذاهاي تخميرشده استفاده ميشوند. همچنين قادر به ترشح بسياري آنزيم ها و توليد آنزيم هاي خارج سلولي شامل کربوهيدرات هاي مختلف ، انواع مختلفي از پروتئازها، پنيسيلين ها، نوکلئازها، فسفاتازها، تياميناز و آنزيم هاي باکتريوليتيک ميباشند. از گونه Bacillus amyloliquefaciens در توليد آلفا آميلاز و شوينده ها استفاده ميشود. سويه هاي آن فعاليت بيولوژيکي ضدقارچي دارند برخي سويه ها در کنترل زيستي استفاده ميشوند و پتانسيل توليد ترکيبات ضدميکروبي متنوع دارند. نمونه خاک از شهرستان آق قلا تهيه و گونه Bacillus amyloliquefaciens جداسازي و شناسايي گرديد.
کلمات کليدي: استخراج DNA، کاربردها، Bacillus amyloliquefaciens، ژن S rRNA١٦
۱. مقدمه و هدف
جنس Bacillus متعلق به خـانواده Bacillaceae رده Bacilli راسـته Firmicutes سلسـله Bacteria مـيباشـد. خـانواده Bacillaceae داراي ١٩ جنس ميباشد. جنس Bacillus، سلول ها ميله اي شکل ، راست يا کمـي خميـده بصـورت منفـرد و جفت جفت ، برخي بصورت زنجيره و گاه بشکل تارهاي بلند وجود دارند. قادر به توليد اسپور بوده که در برابر شـرايط ناسـازگار بسار مقاوم ميباشند. گرم مثبت يا گرم مثبت در مراحل اوله رشد يا گرم منفي هستند. هوازي يا غيرهوازي اختياري ميباشـند.
اما تعداد کمي از گونه ها بشدت غيرهوازي شرح داده شده اند گونه هاي باسيلوس طيـف بسـيار وسـيعي از اشـکال مورفولـوژي کلونيايي را هم درون گونه اي و هم بين گونه اي نشان ميدهند البته ترکيب محيط و ديگر شـرايط انکوباسـيون تـاثير بسـزايي در اين امر دارند.
۲.۱ زيستگاه
گرچه ايزوله هاي بسياري از گونه هاي Bacillus از خاک يا محيط هايي که ممکن است بطور مستقيم يا غير مستقيم توسط خاک آلوده شده باشند بدست آورده شده اند، دامنه منبع جداسازي بسيار گسترده بوده و علاوه بر خاکهاي ملايم ، اسيدي، خنثي يا قليايي، آب هاي شيرين و دريايي، غذاها و نمونه هاي باليني شامل : بافت هاي داخلي گياهان ( Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus endophyticus, Bacillus insolitus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis) ميباشند [٢]. گونه هاي باسيلوس به داشتن نقش در در فرآيند پس از برداشت و توسعه عطر و طعم کاکائو، قهوه ، تنباکو، وانيل ، در توليد فيبرهاي طبيعي و توليدات گياهي ديگر، در تعدادي از غذاهاي تخميرشده سنتي برپايه برگ ها و دانه ها (و تخم ماکيان خانگي) و در کمپوست - سازي مشهور هستند.
۳.۱ ويژگي هاي Bacillus amyloliquefaciens
سويه هاي Bacillus amyloliquefaciens بشدت هوازي، گرم مثبت ، متحرک، ميله اي شکل ، اغلـب بـه صـورت زنجيـره شکل ميگيرند و تشکيل اسپورهاي بيضي شکل ميدهند که بصورت مرکزي، نزديک مرکزي و نزديک انتهـايي در هاگـدان - هاي متورم نشده واقع شدند. در دماي پايين تر از C° ١٥ و بالاتر از C° ٥٠ رشد نميکنند؛ دماي بهينه رشد بـين C° ٤٠-٣٠ ميباشد. کازئين ، الاستين ، اسکولين ، گلاتين ، نشاسته ، توئين ٢٠، ٤٠ و ٦٠ توسط اين گونه تجزيه ميشوند، اما آدنـين ، سـلولز، گوآنين ، هيپوگزانتين ، پکتين ، تستوسترون ، تيروزين ، اوره و گزانتين تجزيه نميشوند. نيترات به نتريت احياء مـيشـود. سـيترات به عنوان منبع کربن منحصر به فرد استفاده ميشود اما پروپيونات خير. رشد در حضور NaCl % ٥ صـورت مـيگيـرد و اغلـب سويه ها NaCl % ١٠ را تحمل ميکنند. اسيد بدون گاز از گلوکز و تعداد ديگري از کربوهيدرات ها توسط اين گونه توليد مـي- شود. اين گونه ها به عنوان منبع با ارزش آنزيم هاي آلفا آميلاز و پروتئاز براي کاربردهـاي صـنعتي داراي اهميـت هسـتند [٢].
سويه هاي Bacillus amyloliquefaciens از کيتين موجود در پسماند سخت پوستان استفاده ميکنند. مشخص شـده اسـت که آنزيم کيتيناز ايزوله خاکي Bacillus amyloliquefaciens که ويژگيهاي ضـد قـارچي دارد]٣[. ايـن موجـود از دامنـه وسيعي از محيط هاي زيست شامل تخميرهاي صنعتي آنزيم آميلاز، غذاها و خاک جداسازي شـده اسـت . ايـن گونـه از لحـاظ فنوتيپي به Bacillus subtilis شباهت دارد. وکر و کمپبل (١٩٦٧) سويه هاي اين ارگانيسم را از کنسـانتره هـاي آلفـا آمـيلاز تجاري جداسازي نمودند [٢]. در اين مقاله جهت بدست آوردن و جداسازي گونـه Bacillus amyloliquefaciens از نمونـه خاک استفاده گرديد.
۲. تئوري و پيشينه تحقيق
در کاربردهاي بيوتکنولوژيکي هميشه راه حل ، انتخاب ميکروارگانيسم صحيح است . اين امر جهت انتخاب ميکروارگانيسم مناسب برا انجام يک فرايند مطلوب بيوتکنولوژيکي مهم ميباشد. حضور ميکروارگانيسم ها در شرايط شديد تنشي يا محيط - هاي آلوده استفاده آن ها را در کاربردهاي بيوتکنولوژيکي مختلف تسهيل ميکند. اخذ چنين سويه هاي تازه اصلاح شده مي - تواند صفت هايي به گياهان اضافه نمايد و آن ها را قادر به رشد در شوري بالا، وفق يافتن به درجه حرارت هاي مختلف يا کنارآمدن موفقيت آميز با تغييرات محيطي غير منتظره نمايد. به علاوه استفاده چنين سويه هاي طبيعي مقاوم در پالايش زيستي فاضلاب در حال حاضر يک نياز ميباشد. در يک تحقيق جمعه و ممتاز (٢٠٠٦) موقعيت طبقه بندي گونه هاي Bacillus را از طريق شناسايي فيلوژنيک S rRNA١٦ تعيين کردند و پايداري خصوصيات آن بعد از واکشت هاي ثانويه در ظرف يک دوره ٣٦ ماهه در مقايسه با نمونه فريزشده براي مدت مشابه مورد آزماش قرار دادند [٣]. البرزيان و حسيني (٢٠١٣) با استفاده از ژن S rDNA١٦ با استفاده از دو مجموعه ساخته شده پرايمرهاي اليگونوکلئوتيد جهاني AGA-'٥ F٢٧ '٣-GTT TGA TCM TGG CTC AG و .'٣-AAG GAG GTG WTC CAR CC-'٥ R١٥٢٥ باکتري Staphylococcus pasteuri RA٣ را ثبت نمودند [٧]. در تحقيقات انجام شده توسط محققين گونه هاي Bacillus جداشده از فاضلاب نساجي از منظر صفاتي مانند تحمل به pH، شوري، درجه حرارت سرد و پراکسيد هيدروژن و مکانيسم مقاومت عليه پراکسيد هيدروژن مورد بهره برداري قرار گرفتند [٤].
۳. مواد و روش ها
۱.۳ جمع اوري نمونه خاک
نمونه خاک از عمق cm ١٥ از استان گلستان شهرستان آق قلا جمع آوري شد بدين ترتيب که ابتدا بـا بيلچـه اقـدام بـه حفـر گودال با عمق مذکور گرديد سپس از اين عمق نمونه خاک به ميزان کافي گرفته و درون کيسـه پلاسـتيکي ريختـه شـد و در يخچال (C°٤) نگهداري شد.
۲.۳ محيط کشت
از محيط کشت (Lysogeny broth)LB جامد (به ازاء هر ليتر: gr Peptone ١٠، gr NaCl ١٠، gr Yeast extract ٥، gr Agar ١٣) جهت کشت استفاده شد. که پس از وزن کردن مواد فوق با استفاده از ترازوي ديجيتال به درون ارلن ريخته شدند و با استفاده از آب مقطر به حجم رسانده شدند و اتوکلاو گرديدند (C°١٢١).
۳.۳ کشت خاک و جداسازي باکتري
نمونه خاک جمع آوري شده از استان گلستان شهرستان آق قلا در آب اتوکلاوشده به غلظت ٢-١٠ درون لوله آزمايش رقيق شد و به منظور جداسازي باسيل گرم مثبت اسپوردار از شوک حرارتي استفاده شد بدين ترتيب که لوله آزمايش حاوي سوسپانسيون خاکي به مدت ١٥ دقيقه داخل آب درحال جوشيدن قرار گرفت و سپس ٢ الي ٣ لوپ از سوسپانسيون بر روي محيط کشت مورد نظر کشت داده شد و در انکوباتور قرار گرفت (دماي C° ٣٢). پس از گذشت ١٤ ساعت اقدام به انتخاب کلنيهاي رشديافته در پتري ديش و واکشت آن ها به طريق کشت چهار منطقه اي گرديد و يک کلني براي مراحل بعدي خالص سازي انتخاب گرديد.
۴.۳ استخراج DNA
براي استخراج DNA از K Buffer استفاده شد (حاوي mM ٢٠ Tris، حاوي mM ١٥٠ NaCl، حاوي mM ١٠ EDTA، % ٢.. SDS) بدين صورت که پس از تهيه پلت از کلوني مورد نظر درون تيوپ ml ٢، μl ٥٠٠ بافر k همراه با μl
٢٥ پروتئاز k به پلت اضافه و در بن ماري C°٣٧ به مدت ٢ ساعت قرار داده شد سپس μl ٧٠٠ فنل کلروفرم ايزوآميل الکل اضافه و به مدت ٦ دقيقه rpm ١١٠٠٠ سانتريفيوژ گرديد و فاز رويي برداشته شد و مرحله قبل تکرار شد. بعد از آن μl ٧٠٠ کلروفرم خالص اضافه و ٦ دقيقه ، rpm ١١٠٠٠ سانتريفيوژ گرديد. در ادامه مايع رويي برداشته شد و μl ٥٠٠ سديم استات N ٣ و cc ١ الکل % ٩٦ اضافه و به مدت ١٠ دقيقه
