بخشی از مقاله
چکیده:
پروتئازها جزء مهمترین آنزیم هاي صنعتی و از اجزاء جدایی ناپذیر صنایع شوینده می باشند. در کشور ما پروتئازها به صورت آماده از خارج وارد می شوند و سالانه بخشی از منابع قابل توجه ارزي مملکت صرف واردات این آنزیم می شود. این مسئله خود اهمیت بررسی تولید پروتئازها، با استفاده از روشها و تکنیک هاي بهینه در داخل کشور را از نقطه نظر اقتصادي مطرح می نماید. این مطالعه به منظور بررسی و معرفی یک روش موثر جهت جداسازي آنزیم پروتئاز قلیایی از باکتري Bacillus Subtilis انجام گرفت.
در این مطالعه عملیات جداسازي آنزیم پروتئاز با کشت باکتري موردنظر در محیط کشت اختصاصی آغاز شد، سپس مراحل مختلف تفکیک با استفاده از پلی اتیلن گلیکول 10.000 دالتون و نمک سدیم سیترات درشرایط pH معین انجام شد . در تمام مراحل، فعالیت پروتئاز قلیایی از طریق هیدرولیز سوبستراي کازئین درpH 8 در مدت زمان مشخص و با اندازه گیري محصول پروتئولیز انجام گرفت. شرایط بهینه براي جداسازي پروتئاز قلیایی % 22 پلی اتیلن گلیکول و% 18سیترات ،%NaCl 10 درpH 7 بدست آمد. پس از اتمام کار ضریب تفکیک، بازیافت و بازده به ترتیب 10.03، % 255.13، 89.89% محاسبه گردید.
مقدمه:
پروتئازها یکی از مهمترین آنزیم هاي صنعتی هستند و حدود %60 از کل فروش آنزیمی جهان را در بر می گیرند 1 - ،4 و. - 5 پروتئازها کاربردهاي متفاوتی در صنایع مختلف نظیر شوینده ها - براي تسهیل آزاد سازي پروتئین ها - - 3 - ، صنایع غذایی - فرایند نرم کردن گوشت،پخت نان، نوشابه سازي - - 9 - ، دارویی، چرم، ابریشم، تشخیصی، براي بازیافت نقره از فیلم هاي عکاسی - 3 - ، سنتز پپتید، پردازش پروتئین، لبنیات - 5 - و نساجی - 10 - دارند.
از این میان آلکالین پروتئازها، اولین بار به عنوان افزودنی هاي تمیز کننده به کار رفتند. از بین پروتئازهاي گوناگون ، پروتئازهاي باکتریایی در مقایسه با پروتئازهاي قارچی و حیوانی حائز اهمیت بیشتري می باشند . - 3 - در سال 1956، سیستم هاي دو فاز آبی براي اولین بار توسط Albertsson براي بازیافت مولکول ها به کار رفت. او نشان داد که میکروارگانیسم ها ، دیواره هاي سلولی ، کلروپلاست ها، وزیکول هاي کلروپلاست و مولکول هاي بیولوژیکی دیگر می توانند به طور انتخابی بین دو فاز یک سیستم دو فاز آبی تفکیک شوند 6 - و. - 9 جهت تشکیل دو فاز در محلول هاي آبی دو پلیمر یا یک پلیمر و یک نمک غیر آلی مورد نیاز می باشد.
- 4 - این سیستم یک تکنیک سریع براي جداسازي و تغلیظ پروتئین ها ي ارگانل هاي سلولی و دیگر محصولات بیولوژیکی است . در صنعت ، اساسًا از سیستم پلیمر- فسفات پتاسیم استفاده می شود اما غلظت بالاي نمک مورد نیاز است که در این صورت مشکل حذف مواد اضافی را به همراه دارد . - 10 - گزارشهاي کمی مبنی بر استفاده از سیستم هاي دوفازي آبی براي تفکیک آلکالین پروتئاز وجود دارد - 7 - وبیشتر گزارشهاي منتشر شده دراستخراج آنزیم آلکالین پروتئاز از گونه هاي باسیلوس حاکی ازمصرف پلی اتیلن گلیکول 1000 در انواع دو فازي آبی پلی اتیلن گلیکول - فسفات پتاسیم و پلی اتیلن گلیکول- دکستران می باشد. گزارشهایی که از پلی اتیلن گلیکول -1000 فسفات پتاسیم و پارامترهاي تحت تاثیرآن نظیر pH و نسبت حجم فاز روي تفکیک و جداسازي آلکالین پروتئازاستفاده شده اند معتبر نبوده است . - 5 -
مواد وروش ها:
در این مطالعه، ابتدا باکتري مورد نظر در شرایط استریل در پلیت هاي حاوي محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شد . سپس کلنی ها یی از محیط کشت نوترینت آگار به منظور تهیه تک کلنی روي محیط کشت اختصاصی کشت داده شد. براي جدا سازي آنزیم تولیدي 100 میلی لیتر از محیط کشت مایع اختصاصی ]گلوکز 5%،0، پپتون 75%،0، سولفات منیزیم%5،0، فسفات پتاسیم 5%،0 ، سولفات آهن% 01 ،[0 با 90 میلی لیتر آب دیونیزه و pH 7 داخل ارلن هاي 250 میلی لیتري ساخته شد و با حجم 5 میلی لیتر در لوله هاي آزمایش مختلف تقسیم شد.
سپس 1،0 میلی لیتر از بذر در شرایط استریل به لوله هاي آزمایش حاوي محیط کشت اضافه شد. پس از آن انکوباسیون در دماي 37˚c و 140 rpm به مدت 72 ساعت انجام شد. در مرحله ي بعد محتویات مخلوط شده ي محیط کشت با استفاده از سانتریفوژ یخچال دار در دماي 3500 rpm, 4˚c سانتریفوژ گردید و بدین ترتیب سلول ها و سایر اجزاي سلولی از بخش آنزیمی و پروتئینی جدا شد و فعالیت آلکالین پروتئازي و میزان پروتئین کل در آن اندازه گیري شد. سپس سیستم هاي دوفازي در دماي 25˚c ساخته شد، در ساخت این سیستم ها ابتدا نمک سیترات و پلی اتیلن گلیکول 10000دالتون با درصد هاي مورد نظر مخلوط شدند. سپس آب و 1 گرم از محلول آنزیمی به هر سیستم اضافه شد تا یک سیستم نهایی با وزن 5 گرم به دست آمد.
سپس دو فاز توسط سانتریفوژ با 3600 rpm و دماي 25˚c به مدت 20 دقیقه جداسازي شد و غلظت پروتئین و فعالیت پروتئاز قلیایی درفاز هاي مختلف سیستم مورد سنجش قرار گرفت. فعالیت پروتئازي بر اساس روش kunitz اندازه گیري شد، براین اساس فعالیت پروتئاز قلیایی عبارت است از میزان آنزیمی که می تواند در مدت 1 دقیقه محصول هیدرولیزي معادل 1 میکرو گرم تیروزین - با اندازه گیري در 280 نانومتر - در دماي 30 درجه سانتی گراد و در pH 8 - بافر پتاسیم فسفات - ، با به کار بردن کازئین به عنوان سوبسترا تولید نماید.
براي اندازه گیري میزان پروتئین کل موجود در هر محیط کشت از روش لوري - lowry - استفاده گردید. ابتدا منحنی استاندارد توسط آلبومین سرم گاوي رسم و غلظت محلول پروتئینی مجهول از طریق آن معین گردید. فعالیت ویژه آنزیمی میزان فعالیت آنزیم به کل پروتئین موجود در محیط است که در هر لحظه می توان با تقسیم کردن فعالیت پروتئاز قلیایی - APU - بر میزان پروتئین - mg - آن را بدست آورد 1 - ،2،4،7و. - 9
نتایج و بحث:
اکثر روش هاي گزارش شده براي جداسازي آنزیم پروتئاز شامل مراحل متعدد نظیر رسوب با آمونیوم سولفات، کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و کروماتوگرافی تعویض یونی می باشد . این روش هاي چند مرحله اي فرایند گران قیمتی هستند و به لحاظ اقتصادي مقرون به صرفه نمی باشند. اما روش ارائه شده در این تحقیق،یک روش بسیار مناسب است که ویژگی هاي آن در سادگی، سرعت بالا و هزینه کم می باشد . - 8 - با توجه به این که سیستم هاي دو فازي براي بازیافت تعداد زیادي از بیومولکول ها نظیر انسولین، پنی سیلین اسیلاز، کوتیناز و... به کار رفته اند اما گزارش کاربردشان در استخراج آلکالین پروتئاز محدود می باشد.
تفکیک آنزیم بین دو فاز یک سیستم با تغییر شرایط سیستم، نظیر pH، نمک و ترکیبات آن قابل تغییر می باشد - . - 5 نتایج به دست آمده از سیستم هاي بررسی شده نشان داد که نمک ها یک تاثیر قوي بر روي رفتار تفکیک پروتئازها دارند. تفکیک پروتئاز با افزودن نمکی نظیر NaCl می تواند پروتئاز را به بخش بالایی در سیستم هاي دو فاز آبی هدایت کند . - 10 - به این طریق که هیدروفوبیسیتی دو فاز را بالا می برد و اکثر پروتئین هاي هیدروفوبیک را به بخش بالایی دوفاز هدایت می کند.
- 6 - حضور نمک می تواند تفاوت هاي الکتریکی قوي بین دو فاز ایجاد کند همچنین می تواند سبب تغییرات ساختاري در آلکالین پروتئاز شود و در نهایت اثرات قابل توجهی روي تفکیک آنزیم به جاي گذارد . - 9 - این تحقیق با درصدهاي مختلف 0 - NaCl،10، - 20.15 مورد بررسی قرار گرفت، در این حالت با افزایش NaCl، ضریب تفکیک و بازده کاهش یافت اما بازیافت افزایش داشت. بهترین مقادیر به دست آمده با NaCl 10%، شامل ضریب تفکیک، بازیافت، بازده، به ترتیب 10.03، % 255.13، 89.89% به دست آمد.
