بخشی از مقاله

چکیده

سویههاي بومی باکتري Bacillus thuringiensis - Bt - از خاكهاي اکوسیستمهاي شهري و بدون پوشش هر یک از شهرستانهاي استان مازندران جداسازي و ژن Cry1 عامل تولید پروتئین موثر بر روي حشرات، در آنها ردیابی شد. پس از جداسازي اختصاصی، کشت کلنیها و رنگ آمیزي اختصاصی، 242 سویه جداسازي گردید که به ترتیب در %14/46 و %7/02 از سویههاي شهري و بدون پوشش پروتئینهاي کریستالی مشاهده شد. در هفت سویه، ژن Cry1 شناسایی شد. آزمایشهاي تعیین ساختار ژنی با استفاده از 14 جفت آغازگر اختصاصی انجام گردید. در این بررسی ژنهاي Cry1Ac، Cry1I و Cry1Ad با بیشترین فراوانی و ژنهاي Cry1B و Cry1J با کمترین فراوانی مشاهده شدند.

.1 مقدمه

امروزه استفاده از ترکیبات شیمیایی به دلیل اثرات مخرب زیستمحیطی و پیامدهاي نامطلوب آن بر روي سلامتی انسان، رو به کاهش بوده و در مقابل تمایل به کاربرد آفتکشهاي سازگار با محیط زیست در حال افزایش است. در مورد کاربرد آفتکشهاي میکروبی بیشترین موفقیت در استفاده از باکتري Bacillus thuringiensis Berliner, 1915 - Bt - بدست آمده است

باکتري Bt گرم مثبت، میلهاي شکل، هوازي، تولیدکنندهي اسپور داخلی بوده و در همهي انواع خاكها یافت میشود

این باکتري در طی فرآیند اسپورزایی، پروتئین کریستالی تولید می کند که دلتا- اندوتوکسین1 نام داشته و قابلیت حشرهکشی زیادي روي لاروهاي Lepidoptera، Coleoptera و Diptera دارد. دو نوع دلتا-اندوتوکسین وجود دارد:

پروتئینهاي کریستالی - Cry - اختصاصی و پروتئینهاي سیتولیتیک - Cyt - غیر اختصاصی. در سال 1989، چهار دسته از ژنهاي Cry و دو دسته از ژنهاي Cyt توصیف شدند . - 3 - ژنهاي Cry1 پروتئینهایی را رمزگردانی میکنند که روي راستهي Lepidoptera سمیت دارد؛ ژنهاي Cry2 روي راستههاي Lepidoptera و Diptera؛ ژنهاي Cry3 روي راستهي Coleoptera؛ و ژنهاي Cry4 روي راستهي Diptera فعالیت دارند

شناسایی ژنهاي Cry باکتري Bt با استفاده از تکنیک واکنش زنجیرهاي پلیمراز 1 - PCR - اولین بار بوسیله کاروزي و همکاران - 1991 - توصیف شد. شناسایی ژنهاي سمی Bt از طریق PCR میتواند در پیشبینی فعالیت حشرهکشی سویههاي شناسایی شده کمک کند. این روشها، سریع، موثر و مطمئن بوده و جانشین مناسبی براي روشهاي سنتی مبتنی بر زیست سنجی هستند

شناسایی سویههاي داراي پتانسیل کاربردي در کنترل بیولوژیک، نتیجهي برنامههاي غربالگري بیشماري در سراسر دنیا است. بیشتر این برنامهها داراي دو موضوع اصلی هستند:

-1 انتخاب سویههاي Bt جدید کاراتر از سویههاي قبلی

-2 جداسازي سویههاي Bt جدید که داراي میزبانهاي جدید و بیشتر باشند

هدف پژوهش حاضر جداسازي و غربالگري سویههاي بومی Bt از خاكهاي اکوسیستمهاي شهري و بدون پوشش شهرستانهاي استان مازندران بود. همچنین کاربرد شیوههاي مولکولی براي بررسی وجود ژن Cry1 که عامل تولید توکسین موثر روي حشرات آفت راستهي بالپولکداران است، از دیگر اهداف این پژوهش بود. علاوه بر این با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی براي زیرگروههاي ژن Cry1، ژنوتیپ سویههاي داراي این ژن تعیین و قابلیت احتمالی حشرهکشی آنها پیشبینی شد.

.2 مواد و روشها

نمونه برداري

براي نمونهبرداري خاك هایی از عمق 2-5 سانتیمتري جمعآوري گردید. این نمونهها از مناطق مختلف خاكهاي شهري و بدون پوشش استان مازندران جمعآوري شد. نمونهبرداري از 16 شهرستان استان مازندران شامل: بهشهر، نکا، ساري، جویبار، قائمشهر، سوادکوه، بابل، بابلسر، محمودآباد، فریدونکنار، آمل، نور، نوشهر، چالوس، تنکابن و رامسر انجام شد. از هر شهرستان دو نمونه و در مجموع 64 نمونهي خاکی براي جداسازي باکتري Bt جمعآوري گردید.

جداسازي اختصاصی باکتري Bt
براي جداسازي باکتري Bt از روش انتخابی سدیم استات استفاده شد. بدین طریق که یک گرم از نمونه بمدت 3 ساعت در 30˚C در 20 میلیلیتر محیط کشت مایع محتوي استات سدیم - pH: 6/8 - 0/25 M کشت داده شد. استات سدیم بطور اختصاصی مانع جوانه زنی اسپورهاي Bt میشود. در ادامه یک میلیلیتر از هر نمونه کشت داده شده تحت شوك حرارتی 60 تا 70˚C قرار گرفت. بدین ترتیب اسپورهاي جوانه زده سایر باکتريها از بین رفته و تنها اسپورهاي مقاوم و جوانه نزدهي Bt باقی میماند. سپس نمونه ها روي محیط هاي کشت معمول یا اختصاصی T3 ,LBA - Bt و - CCY کشت داده شدند. پس از گذشت 3-5 روز از کشت، کلنیهاي باکتري بر اساس شکل ظاهري کلنی - سفید مات - گزینش اولیه شده و در داخل آب نمک %0/9 در دماي 4 ˚C نگهداري شدند

کشت باکتري و شناسایی میکروسکوپی

سویههاي جداسازي شده بر روي محیط کشت LBA تک کلون شدند. پس از گذشت 3-5 روز از کشت، با استفاده از شیوهي رنگآمیزي کوماسیبلو از نمونهها اسلاید تهیه شد و نمونهها بر اساس شاخصهاي میکروسکوپی Bt شناسایی شدند.

استخراج DNA باکتري

نمونههاي باکتري روي محیط کشت LBA تکثیر شدند. مقداري نمونه کشت شده داخل یک میلیلیتر از محلول 1 حاوي 0/01 M - Tris با - pH: 8، - 0/001 M - EDTA و - 1M - NaCl قرار گرفته و سانتریوفوژ شدند. سپس به پلت 200 µl از بافر استخراج 0/025 M - Tris - با - pH: 8، - 0/01 M - EDTA، ساکارز %25 و لایزوزایم - - 4 mg/ml - اضافه شد و یک ساعت و نیم در دماي 37 ˚C باقی ماند. سپس 100µl از محلول 2 حاوي 10 M - NaOH بمیزان 2 میلیلیتر - ، SDS 10 - درصد بمیزان 10 میلیلیتر - و آب مقطر استریل 88 - میلیلیتر - اضافه شد و در دماي -20˚C به مدت 20 دقیقه باقی ماند. سپس 200µl از - 5 M - NaCl به آن اضافه و بمدت 40 دقیقه در -20˚C قرار داده شد. بعد از آن نمونهها در 15000 دور به مدت پنج دقیقه در دماي 4˚C سانتریوفوژ شد. محلول رویی به میکروتیوپ جدید منتقل شده و به مقدار 1/5-2/5 برابر محلول برداشته شده به آن اتانول سرد - -20˚C - اضافه و سانتریفوژ شد. پلت با اتانول %70 دو بار شست و شو شده و پس از خشک کردن پلت، در محلول TE - محتوي Tris به غلظت 10 mM و EDTA به غلظت - 1 mM حل شد.

طراحی آغازگر

با مبنا قرار دادن بانکهاي اطلاعاتی عمده و توالیهاي ژنی ارائه شده براي ژنهاي اختصاصی Cry1، آغازگرهاي مختلفی سنتز شدند. در این پژوهش Cry1 و 14 زیر مجموعهي این ژن Cry1Aa - ، Cry1Ab، Cry1Ac، Cry1Ad، Cry1B، Cry1C، Cry1D، Cry1E، Cry1F، Cry1G، Cry1H، Cry1I، Cry1J و - Cry1K با استفاده از 15 جفت آغازگر
- 9 - مورد بررسی قرار گرفت.

ردیابی مولکولی ژن Cry1 و زیر مجموعههاي آن

اجزاي واکنش زنجیرهاي پلیمراز بهینه شده براي ژنهاي Cry1 در حجم 25 µl شامل: 2 µl از DNA، 0/5 µl از dNTP - غلظت نهایی: - 0/2 mM، 0/2 µl آنزیم Taq DNA Polymerase - مقدار نهایی: یک واحد - ، 2 µl از هر کدام از آغازگرها - غلظت نهایی - 0/8 µM، 1 µl از MgCl2 - غلظت نهایی: - 2 mM، 2/5 µl بافر PCR - مقدار نهایی - 1 X و 14/8 µl آب مقطر استریل بود. مراحل واکنش بترتیب شامل واسرشتهسازي اولیه در دماي 94˚C به مدت پنج دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشتهسازي در دماي 94˚C به مدت 45 ثانیه، اتصال به مدت یک دقیقه و 30 ثانیه در 45˚C و مرحله طویل شدن به مدت یک دقیقه و 30 ثانیه در 72˚C و طویل شدن نهایی به مدت پنج دقیقه در دماي 72 ˚C بود.

اجزاي واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي 14 زیر مجموعهي ژنی Cry1 با ایجاد تغییرات جزئی در مقدار MgCl2 و دماي مرحله اتصال در چند ژن بهینهسازي گردید. محصول واکنش با استفاده از ژل آگاروز %2 الکتروفورز شد.

.3 نتایج و بحث

جداسازي و شناسایی سویهها بر اساس شاخصهاي مورفولوژیک

جدایهها بر اساس شکل ظاهري کلنی Bt - سفید مات - از 64 نمونه از خاكهاي شهري و بدون پوشش شهرستانهاي مختلف استان مازندران گزینش اولیه شدند. در این مرحله 242 جدایه 146 - سویه شهري و 96 جدایه بدون پوشش - گزینش و سپس با استفاده از شیوهي رنگ آمیزي کوماسیبلو و بر اساس شاخصهاي میکروسکوپی باکتري Bt - تولید اسپور، کلاهک - Cap - و کریستال - شناسایی شدند

در متن اصلی مقاله به هم ریختگی وجود ندارد. برای مطالعه بیشتر مقاله آن را خریداری کنید