بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش حساسیت 3 سن لاروی Diaphania indica در برابرباکتری Bacillus thuringiensis بررسی گردید. برای تخمین Lc50 از شش غلظت مختلف باکتری که با فواصل لگاریتمی محاسبه شده بودند. به همراه یک شاهد برای هر سن لاروی به طور جداگانه استفاده شد. مقادیر LC50 برای لارو سن اول، که تنها 4-1 ساعت پس از خروج از تخم تیمار شدند، 78/401 ppm، برای لاروهای سنین دوم و سوم به ترتیب 101/282ppm و 328/50 ppmبرآورد گردید. بدین ترتیب مشخص شد که حساسیت لاروها با افزایش سن کاهش می یابد و در نتیجه برای کنترل این آفت در گلخانه بهتر است هم زمان با اوج تفریخ تخم ها باکتری پاشی شود.
واژه های کلیدی: باکتری Bacillus thuringiensis ، برگخوار کدوییان
مقدمه
کرم برگخوار کدوییان Diaphania indica آفت جدیدی است که در سال 1380 برای اولین بار در ایران ، از سطح گلخانه های خیار منطقه جیرفت جمع آوری و شناسایی شد . - 19 - میزان خسارت آن روی خیار به خصوص در مراحل رشدی بسیار بالا است زیرا از جوانه انتهایی گیاه تغذیه می کند، به همین منظور در ابتدای فصل سم پاشی ها آلودگی محیط زیست و به خطر انداختن سلامت کارگران و مصرف کنندگان را در پی دارد. برای کاهش آثار سو جانبی و کنترل بهینه آفت، کوشش های بسیاری در استفاده از روش های گوناگون مبارزه، از جمله استفاده از سموم میکروبی مختلف می شود - . - 6
از این ترکیبات میکروبی باکتری Bacillus thuringiensis است که کاربرد آن در جهان علیه آفات مختلف رو به افزایش است - . - 17 از این باکتری تاکنون جدایه های بسیاری به دست آمده، که از میان صدها جدایه، مهم ترین و کاربردی ترین آنها زیر گونه Bacillus thuringiensis kurstaki است. از ویژگی های بارز این جدایه ها تولید یک یا چند بلور لوزی شکل است.
مدت کوتاهی پس از هضم در معده حشرات حساس، این بلورها در محیط پیش معده لارو تجزیه شده، ترکیب پروتیینی آنها توسط پروتیاز معده به پپتید تبدیل می شود. که یک یا چند از آنها که یک توکسین سیتولتیک برای سلولهای اپیتلیوم معده لاروها تولید کنند دلتااندوتوکسین گفته می شود.این باکتری دارای فرمولاسیون های تجاری متعدد است، که بر اساس نوع زیر گونه و سویه فرموله شده و دامنه میزبانی گسترده ای دارد . - 14 -
آندوتوکسین های تولید شده بوسیله جدایه های مختلف این باکتری منجر به مرگ بسیاری از گونه های حشرات راسته بالپولکداران، سخت بالپوشان و دوبالان می شود. پروتوکسین باکتری باید به وسیله میزبان خورده شود تا درون دستگاه گوارش آزاد گردد، و پس از گذشتن از موانع فیزیکی و شیمیایی در بدن میزبان اثر خود را اعمال کند. غشای دور غذا - Perithrophic membrane - به عنوان لایه نگهدارنده ی سلولهای اپیتلیوم عمل می کند، بنابراین نخستین مانع محسوب می شود و در حل شدن و تبدیل پروتوکسین به فرم فعال آن، آنزیم های گوارشی و ph معده نقش بسیار مهمی دارد - . - 5
توجه به اهمیت آفت مذکور و لزوم کاهش مصرف حشره کش های شیمیایی علیه آن در مدیریت تلفیقی آفات، و نیز افزایش اهمیت باکتری Bacillus thuringiensis از دلایل انجام این پژوهش است.
مواد و روش ها
میزبان
لاروهای مورد نیاز از کلنی پرورشی موجود در آزمایشگاه مرکز تحقیقات کشاورزی جیرفت تامین شد. کلنی ها از تخم های پروانه های حاصل از پرورش لاروهای جمع آوری شده از گلخانه های خیار بدست آمده اند. این حشرات در بهار 1391 در شرایط 25 2 سانتی گراد و رطوبت 65 5 درصد روی گلدان های خیار پرورش داده شدند.
برای بدست آوردن لاروهای هم سن، از خیارهای کاشته شده در گلدان ها استفاده گردید. بدین ترتیب که روی هر گلدان چند برگ بزرگ و شاداب انتخاب شد و بدون جدا کردن آنها از بوته، داخل ظروف بستنی یک کیلویی - به قطر 15 و بلندی 7 سانتی متر - از شیاری که در لبه آنها تعبیه شده بود قرار داده شد، و برای آسیب نرسیدن به دمبرگ در داخل شیار دور آنها پنبه گذاشته شد، و دهانه ظرف پرورش به وسیله پارچه سفید مسدود گردید.
برگهای خیار به نحوی درون ظروف قرار گرفتند که امکان خروج لاروها وجود نداشت داخل هر ظرف روی هر برگ دسته تخم های چندتایی گذاشته شد. لاروها پس از تفریخ از تخم، از برگ تغذیه می نمودند. در صورت اتمام برگ، که با رشد و افزایش تغذیه لاروها سریع تر می گردید، برگ دیگری به داخل ظرف هدایت می شد. بدین ترتیب پرورش لاروها تا پایان مرحله رشد و نمو لاروی ادامه یافت.
عامل بیماریزا
الف - باکتری: باکتری مورد نظر از ترکیب تجاری Belthirul که حاوی Bacillus thuringiensis var. kurstaki و سویه PB54 بود تامین شد. این ترکیب دارای فرمولاسیون پودر وتابل بوده و واحد استاندارد آن برابر با 32.000I.U./mg. از فراورده می باشد.
ب - بررسی حساسیت سنین مختلف: برای بررسی تلفات ایجاد شده در لاروهای سنین اول، دوم و سوم و تخمین Lc50، شش غلظت مختلف باکتری با فواصل لگاریتمی تهیه گردید، بررسی ها با هفت تیمار - شش غلظت باکتری به علاوه یک تیمار شاهد - و سه تکرار برای هر تیمار انجام شد. روش کار بدین ترتیب بود که پس از آلوده سازی برگ های مورد نظر آنها درون ظروف بستنی محصور شد، و سپس تعداد10 لارو هم سن و هم اندازه، که با استفاده از روش اندازه گیری عرض کپسول سر تفکیک شده بودند، درون تله ها رها سازی شدند. شرایط نگهداری لاروهای آزمایش کاملا مشابه شرایط پرورش بود و شمارش تلفات هر 24 ساعت انجام شد.
ج - طرز تهیه غلظتهای س از انجام آزمایشات مقدماتی بر روی لاروهای سن اول مشخص گردید که بالاترین و کمترین غلظت موثر باکتری بر روی این سن به ترتیب کمترین 400ppm و 40ppm تعیین شد که در آزمایش های مقدماتی به ترتیب 90و 25 درصد تلفات ایجاد کرده بودند. سپس بر اساس روش مراد اسحقی و پورمیرزا - 1353 - غلظت های مابین این دو به روش لگاریتمی محاسبه شد، که غلظت های بین این دو، عبارتند از: 40، 60، 158،100، 250 و .400ppm با توجه به افزایش مقاومت لاروهای سن دوم، غلظت حداکثر باکتری با رعایت فواصل لگاریتمی دو رده بالاتر برده شد و از سوی دیگر دو غلظت پایینی حذف شدند. البته افزایش غلظت بر اساس فواصل لگاریتمی صورت گرفت و برابر بود با 630ppm و 1000ppm و در مورد لارو سن سوم نیز به همان ترتیب غلظت باکتری بر اساس فواصل لگاریتمی دو رده افزایش داده شده و دو غلظت پایینی حذف گردید. بر این اساس دو غلظت بالایی جدید برای سن سوم عبارت بودند از: 1580ppm و .2510ppm
تجزیه و تحلیل داده ها: داده های حاصل از آزمایشات با استفاده از برنامه Spss به روش پروبیت بررسی و مقادیر LC50 محاسبه و نمودارها با برنامه Excel رسم گردید.
نتایج و بحث
لارو سن اول
شکل 1 نمودار لگاریتم دوز و پروبیت درصد تلفات لاروهای سن اول که از غلظت های مختلف ترکیب تجاری Belthirul تغذیه کرده بودند، را پس از 72 ساعت نشان می دهد. همانگونه که در نمودار مذکور مشاهده می شود، تلفات لاروها روند افزایشی یکنواختی را نشان می دهد. پس از تجزیه پروبیت داده ها، LC50 باکتری مذکور برابر با 78/401ppm برآورد شد. با بررسی روند تلفات لاروها در زمانهای مختلف مشاهده گردید، که در غلظت های 40ppm تا 400ppm تلفات در 24 ساعت اول کم و در این تیمارها مرگ و میر از 48 تا 72 ساعت به اوج خود می رسد. همان گونه که در جدول مشاهده می شود مقدار کای اسکور محاسبه شده معنی دار نبوده لذا بین داده ها هتروژنسیتی وجود ندارد.
لارو سن دوم
شکل 2 نمودار لگاریتم دوز و پروبیت درصد تلفات لاروهای سن دوم را که از غلظت های مختلف ترکیب تجاری Belthirul تغذیه کرده بودند را پس از 72 ساعت نشان می دهد. همان گونه که در این نمودار مشاهده می شود، تلفات لاروها در ارتباط با افزایش غلظت باکتری روند افزایشی تقریبا یکنواختی دارد. پس از انجام محاسبات پروبیت، LC50 باکتری در برابر لاروهای سن دوم این حشره 101/282ppm برآورد گردید. با بررسی روند تلفات لاروهادر
