بخشی از مقاله
چکیده
وجود dsRNA در 66 جدایه قارچ Macrophomina phaseolina جمع آوري شده از مناطق مختلف ایران از میزبانهاي مختلف مورد بررسی قرار گرفت . استخراج قطعات dsRNA از توده میسلیومی قارچ با استفاده از کروماتوگرافی با ستون سلولز CF-11 انجام شد. در 18 جدایه از جدایههاي فوق قطعات dsRNA با اندازههاي ژنومی متفاوت از 0/9 تا 12 کیلو جفت باز جدا گردید. جهت بررسی تأثیر dsRNA روي برخی از خصوصیات بیولوژیکی جدایههاي قارچی، با ماده سیکلوهگزامید در غلظت 100ppm اقدام به حذف ویروس گردید. در 11 جدایه قطعات dsRNA حذف شدند. 11 جدایه حاوي dsRNA و 11 جدایه عاري شده از dsRNA از نظر برخی از خصوصیات بیولوژیکی نظیر رشد رویشی و شدت بیماریزایی مورد بررسی قرار گرفتند.نتایج حاکی از آن است که مایکوویروسها میتوانند اثرات مختلفی روي مورفولوژي و بیماریزایی قارچ داشته باشند. در برخی از جدایهها dsRNA موجب افزایش رشد رویشی و افزایش شدت بیماریزایی و در برخی موجب کاهش صفات مذکور شد. در تعدادي از جدایهها نیز ارتباطی میان حضور dsRNA و صفات نام برده شده وجود نداشت. در چهار جدایه، dsRNA موجب کاهش بیماریزایی بر روي ریشههاي چغندرقند شد. این نتایج بیانگر وجود ارتباط میان حضور dsRNA و پدیده هیپوویرولانس در قارچ M. phaseolina میباشد.
کلمات کلیدي: dsRNA، Macrophomina phaseolina، مایکوویروس، هیپوویرولانس
مقدمه
قارچ Macrophomina phaseolina یکی از عوامل بیماریزاي گیاهی خاکزي بوده که موجب بیماري پوسیدگی ذغالی ریشه در بسیاري از گیاهان زراعی میشود. قارچ عامل بیماري داراي دامنه میزبانی وسیع بوده و یکی از میزبانهاي مهم آن در ایران چغندرقند است. این بیمارگر به دلیل دامنه میزبانی وسیع و فراهم بودن شرایط مناسب بیماریزایی، در اکثر مناطق تهدیدي جدي براي توسعه کشت گیاهان زراعی میباشد؛ لذا مدیریت بیماري حائز اهمیت است. بطور کلی اقدامات انجام گرفته جهت مدیریت این بیماري را میتوان به چهار دسته مبارزه شیمیایی، مبارزه زراعی، مبارزه بیولوژیک و استفاده از ارقام مقاوم طبقهبندي نمود.
امروزه به دلیل هزینههاي بالاي استفاده از سموم شیمیایی، اثر بقایاي سموم در محیط زیست، عدم ظهور بیماري تا زمان متلاشی شدن میزبان و مشکل بودن تعیین زمان سمپاشی و عدم توسعه ارقام مقاوم به این بیماري، توجه محققین به سمت روشهاي مبارزه بیولوژیک به عنوان راهی براي مهار بیماري معطوف شده است. استفاده از ویروسهاي قارچی - مایکوویروسها - به عنوان یکی از روشهاي نوین مبارزه بیولوژیک بیماريها مطرح میباشد . این تحقیق به منظور جداسازي dsRNA هاي ویروسی از جدایههاي قارچ Macrophomina phaseolina جمع آوري شده از میزبانهاي مختلف از مناطق مختلف ایران و بررسی اثر آنها بر روي برخی از خصوصیات مورفولوژیکی و بیماریزایی جدایهها انجام شد.
مواد و روشها
-1 جمع آوري و خالص سازي جدایههاي قارچ Macrophomina phaseolina و تهیه توده میسلیومی : 66 جدایه استفاده شده در این تحقیق از کلکسیون جدایههاي قارچی بخش تحقیقات گیاهپزشکی موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند تهیه گردید. این جدایهها پس از خالص سازي در محیط مایع PDB براي تولید توده میسلیومی کشت شدند . - 2 -
-2 جداسازي dsRNA از توده میسلیومی و بررسی تنوع آن در جدایههاي قارچی: جداسازي dsRNA از تودههاي میسلیومی صاف شده، بر مبناي روش پیشنهادي توسط هاشمی و مظفري انجام شد . - 5 - ابتدا بافتهاي قارچی بوسیله نیتروژن مایع پودر شده، سپس به آنها بافر استخراج حاوي STE2X و فنول اشباع شده با استات سدیم اضافه گردید. با سانتریفیوژ کردن به مدت چهل دقیقه با سرعت 6500 دور در دقیقه، بقایاي میسلیومی قارچ رسوب داده شد. براي جداسازي افتراقی dsRNA، مایع صاف شده رویی حاوي انواع مختلف اسیدهاي نوکلئیک از ستون سلولز CF-11 اشباع شده با بافر STE حاوي %16 اتانول عبور داده شد.در نهایت dsRNA با سانتریفیوژ کردن به مدت 70 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه در دماي -10 درجه سانتیگراد رسوب داده شد.
این رسوب در 70 میکرولیتر بافر TE حل گردید. براي بررسی وجود یا عدم وجود و کیفیت وزن مولکولی dsRNA، از الکتروفورز افقی در ژل آگاروز %0/8 استفاده گردید. مشاهده و تعیین وزن مولکولی باندها با دستگاه Gel– documentation انجام شد . - 2 - جهت اثبات ماهیت dsRNA بودن قطعات استخراج شده، از تست آنزیمی توسط آنزیم RNase A در غلظتهاي بالا و پایین نمک - NaCl 0.3 M & NaCl 0.03 M - و با بهرهگیري از خاصیت مقاومت و یا حساسیت dsRNA در برابر آنزیم استفاده شد . - 3 - براي بررسی تفاوتهاي مورفولوژیکی ناشی از حضور dsRNA در جدایههاي قارچی، از روش تهیه جدایه عاري از dsRNA استفاده شد. براي حذف dsRNA از میسلیوم قارچ، از ماده سیکلوهگزامید به عنوان ممانعت کننده از سنتز RNA و پروتئینها در غلظت 100ppm استفاده گردید . - 6 -
-3 ارزیابی رشد رویشی جدایهها: میزان رشد میسلیومی جدایههاي حاوي و عاري شده از dsRNA، در محیط کشت PDA در دماي 25 درجه سانتیگراد، با اندازه گیري روزانه قطر کلنی از پشت پتري یادداشت شد. یادداشت برداري 48 ساعت پس از کشت شروع و به مدت 3 روز - زمان پر شدن کامل پتریها - بطول انجامید - 2 - این. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با4 تکرار براي هر جدایه حاوي و عاري شده از ویروس و دوبار انجام شد. دادههاي بدست آمده توسط نرم افزار آماري SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و میانگینها به روش T-test در سطح %1 و %5 مقایسه شدند.
-4 بررسی تأثیر dsRNA روي بیماریزایی جدایهها: بررسی تأثیر dsRNA روي بیماریزایی جدایهها در شرایط آزمایشگاه و با استفاده از روش تهیه مایه تلقیح با خلال دندان انجام شد . - 4 - جدایههاي حاوي و عاري شده از dsRNA روي ریشههاي بالغ چغندرقند رقم گدوك مایه زنی شدنداین. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با ده تکرار براي هر جدایه حاوي و عاري شده از dsRNA و دوبار انجام شد. بعد از گذشت یک هفته ریشهها در محل مایه زنی، برش عرضی داده شدند و در صورت مشاهده علائم پوسیدگی و تغییر رنگ، میزان پوسیدگی در داخل بافت توسط مقیاس بوتنر و همکاران یادداشت برداري شد . - 1 - شاخص شدت بیماري با محاسبه میانگین نمرات هر ریشه در مقیاس 1 تا 9 براي هر جدایه و در تمام تکرارها محاسبه شد. دادههاي بدست آمده توسط نرم افزار آماري SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت ومیانگینها به روش در سطح %1 و %5 مقایسه شدند.
نتایج و بحث
در 18 جدایه از 66 جدایه مورد بررسی، قطعات dsRNA با اندازههاي ژنومی متفاوت بین 0/9 تا 12 کیلو جفت باز مشاهده گردید - جدول 1 و شکل . - 1 این جدایهها از میزبانهاي چغندرقند، کنجد و سویا و از استانهاي قزوین، همدان، کرمان، خوزستان و گلستان جمع آوري شده بودند. تعداد قطعات dsRNA و تنوع در وزن مولکولی آنها در برخی از جدایههاي قارچ M. phaseolina توسط محققینی چون Pecina و همکاران نیز تأیید شده است . - 7 - ماهیت dsRNA بودن قطعات استخراج شده با توجه به مقاومت قطعات اسید نوکلئیک جدا شده از قارچ نسبت به تیمار آنزیمی با آنزیمRNase A در غلظت بالاي نمک - NaCl 0.3 M - و حساسیت آن به تیمار آنزیمی در غلظت پایین نمک - NaCl 0. 03 M - و مقاومت به DNase ثابت شد . - 3 - با استفاده از ماده سیکلوهگزامید در غلظت 100ppm، در 11 جدایه از 18 جدایه حاوي ویروس قطعات dsRNA حذف شدند.
نتایج بدست آمده در بررسی تأثیر dsRNA بر رشد رویشی جدایهها بیانگر آن است که بین تیمارهاي حاوي و عاري شده از ویروس در 5 جدایه در سطح %1 تفاوت معنی داري وجود دارد. این تفاوت در جدایههاي KB2 و P1M4 به صورت کاهش رشد رویشی در تیمار حاوي ویروس نسبت به تیمار عاري شده از ویروس و در جدایههاي P3M3، P2M2 و SK1 به صورت افزایش رشد رویشی در تیمار حاوي ویروس نسبت به تیمار عاري شده از ویروس میباشد. همچنین نتایج بدست آمده در این پژوهش نشان داد که dsRNA و مایکوویروسها علاوه بر میزان رشد قارچ در برخی از موارد بر روي شکل کلنی نیز تأثیر گذار میباشند. این مهم در جدایه P1M5 حاوي و عاري شده از ویروس به خوبی مشخص است - شکل . - 2
