بخشی از مقاله
چکیده:
گروهی از باکتريها توانایی تولید بیوپلیمر پلیهیدروکسیآلکانوات - PHA - را در صورت کمبود منابع مغذي و مقدار اضافی کربن دارند. در این پژوهش گونههاي میکروبی از فاضلاب کارخانجات شیر پگاه کرمان، روغن نباتی گلناز کرمان و نوشابه زمزم کرمان جدا شده و مورد بررسی قرار گرفت و در بین آنها گونه Bacillus subtilis جدا شده از کارخانه شیر بهترین گونه تولید کننده انتخاب شد که در حضور گلوکز و عصاره مخمر به عنوان منابع کربن توانایی تولید پلیهیدروکسیبوتیرات - PHB - بیشتري دارد. PHB تولید شده به کمک متانول اسیدي و کلروفرم تحت واکنش استریفیکاسیون قرار گرفت و به متیلاستر مربوطه تبدیل و به کمک دستگاه کروماتوگراف گازي آنالیز شد.
مقدمه:
پلیهیدروکسیآلکانواتها1 گروهی از پلیاسترها هستند که میکروارگانیسمها به عنوان ذخیره انرژي به صورت درون سلولی در خود ذخیره میکنند و این ذخیره به دلیل کمبود منابع مغذي مانند فسفر، نیتروژن، پتاسیم و یا اکسیژن در حضور مقدار اضافی منابع کربن میباشد - . - 4 بیوپلیمرها بر اساس طول زنجیره کربنی به سه دسته تقسیم میشود: زنجیره کوتاه با زنجیره منومري 3 تا 5 اتم کربن، زنجیره متوسط با زنجیره منومري 6 تا 14 اتم کربن و ترکیبی از زنجیره کوتاه و زنجیره متوسط که خواص فیزیکی و مکانیکی بهتري نسبت به دو گروه قبلی دارد - 3، PHA . - 5 خواص ترموپلاستیکی شبیه به پلیمرهاي صنعتی دارد با این مزیت که زیستتخریبپذیر، زیستسازگار و قابل تهیه از منابع تجدیدپذیر میباشد ولی به علت هزینههاي بالاي تولید توانایی رقابت با پلیمرهاي صنعتی را ندارد - . - 1
مواد و روشها: جداسازي گونه میکروبی:
در این تحقیق از گونههاي میکروبی بومی موجود در استان کرمان استفاده شد. براي این کار گونههاي میکروبی موجود در فاضلاب کارخانجات روغن نباتی کرمان، نوشابه زمزم کرمان و شیر پگاه کرمان مورد بررسی قرار گرفتند. نمونههاي فاضلاب در ظرف استریل شده پلیاتیلنی با لایه داخلی پلیآمید در مقیاس 1 لیتر در شرایط استریل برداشته شدند و براي جلوگیري از اتلاف نمونههاي هوازي تا رسیدن به آزمایشگاه، ظرف نمونه تا 0/25 لیتر از هوا پر شد.
براي جداسازي گونههاي میکروبی 1 قطره از هر فاضلاب را با آب مقطر استریل، رقیق کرده و به روش استریک پلیت2 بر روي محیط کشت نوترینت آگار3 کشت داده و به مدت 48 ساعت در دماي 30 درجه سانتیگراد گرما گذاري شد - . - 8 کلنیهاي مجزا به لحاظ شکل، رنگ و مشخصات ظاهري مجدداًبا تکنیک کشت استریک پلیت جداسازي شدند. گونههاي قارچ، کپک، مخمر و سایر میکروارگانیسمهاي مزاحم حذف و سپس نمونههاي خالص روي اسلنت نگهداري شدند. براي اطمینان از خلوص نمونهها رنگ آمیزي گرم انجام شد - . - 8 در این مرحله 40 توده میکروبی انتخاب شد.
انتخاب گونههاي تولید کننده پلیهیدروکسیآلکانوات:
براي مشخص کردن گونههاي تولیدکننده PHA از روش رنگ آمیزي سودان سیاه2 استفاده شد. پس از انجام رنگ آمیزي گونههایی که توانایی بیشتري در تولید PHA داشتند انتخاب شدند - . - 6 روش رنگ آمیزي سودان سیاه: پس از تهیه و تثبیت گسترش میکروبی 40 گونه جداسازي شده روي لام، محلول سودان سیاه 0/3 - گرم سودان سیاه 100 + میلیلیتر اتانول - %70 که تازه تهیه شده به مدت 10 دقیقه روي آن قرار گرفت.
پس از شستشو با آب مقطر و خشک کردن لام توسط کاغذ صافی، شستشو با زایلین تا شفاف شدن کامل لام انجام و سپس سطح لام به مدت 10 الی 15 ثانیه با محلول %0/5 سافرانین آغشته شد. پس از شستشو با آب مقطر و خشک کردن لام با کاغذ صافی PHA به صورت لکههاي سیاه رنگ درون باکتريها با لنز 100 میکروسکوپ نوري مشاهده شد - - 2، - شکل . - 1 پس از رنگ آمیزي سودان سیاه 14 گونه که توانایی تولید داشتند انتخاب و در محیط کشت مایع، کشت داده شدند.
شرایط محیط کشت:
تولید بیومس ابتدا در محیط کشت بذر به مدت 48 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد به منظور کاهش فاز تاخیري رشد انجام شد، ترکیب محیط کشت بذر به صورت زیر میباشد: KH2PO4 ، 2/5 گرم در لیتر، K2HPO4 ، 2/5 گرم در لیتر، NH4NO3 ، 0/5 گرم در لیتر، - NH4 - 2HPO4، 1 گرم در لیتر، MnSO4.7H2O ، 0/007 گرم در لیتر، MgSO4.7H2O ، 0/2 گرم در لیتر، FeSO4.7H2O ، 0/01 گرم در لیتر. مقدار 9 و 2/5 گرم در لیتر از گلوکز و عصاره مخمر به ترتیب به عنوان منبع کربن به صورت مجزا استریل و به محیط کشت استریل اضافه شد. ترکیب محیط کشت تخمیر مانند محیط کشت بذر میباشد با این تفاوت که مقدار 30 و 7/5 گرم در لیتر از گلوکز و عصاره مخمر به ترتیب به عنوان منبع کربن مورد استفاده قرار گرفت و به مدت 30 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد گرماگذاري شد - . - 2
آنالیز پلیهیدروکسیبوتیرات1 با استفاده از کروماتوگراف گازي:2
پس از پایان گرماگذاري مقدار 10 میلیلیتر از هر محیط کشت به مدت 15 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ3 و مایع رویی دور ریخته شد. بیومس4 حاصل با 10 میلیلیتر آب مقطر شستشو و جهت حذف مواد اضافی 15 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. با دور ریختن مایع رویی مقدار 2 میلیلیتر کلروفرم و 1 میلیلیتر متانول اسیدي - شامل %85 حجمی- حجمی متانول، %15 حجمی- حجمی اسید سولفوریک و 45 گرم در لیتر اسید بنزوییک به عنوان استاندارد داخلی - به بیومس به دست آمده و نمونه استاندارد PHB اضافه شد. نمونهها و استاندارد به مدت 2 ساعت در دماي 100 درجه سانتیگراد تا کامل شدن واکنش استري شدن نگهداري شدند.
سپس به هر نمونه 1 میلیلیتر آب دوبار تقطیر اضافه و به مدت 1 دقیقه به شدت تکان داده شد - 2 ، . - 7 با تکان دادن شدید و آرام گرفتن، سه فاز مجزا تشکیل شد - فاز بالایی حاوي اسید سولفوریک، فاز میانی حاوي بقایاي میکروبی و فاز پایینی حاوي متیلاستر هیدروکسیآلکانوات - ، دو فاز بالایی را توسط پیپت خودکار5 دور ریخته و فاز زیرین توسط پیپت پاستور به لوله آزمایش تمیز منتقل و تا قبل از تزریق به دستگاه کروماتوگراف گازي درون یخچال نگهداري شد.
مقدار 2 میکرولیتر از نمونهها و نمونه استاندارد، به صورت جداگانه به دستگاه کروماتوگراف گازي تزریق شدند. مشخصات دستگاه به شرح زیر میباشد: کروماتوگراف گازي ساخت شرکت واریان6 با ستون مویینCP- - 7 Cil 5CB طول 30 متر و قطر 0/32 میلیمتر - ، نمایانگرFID 8، دماي تزریق کننده250 9 درجه سانتیگراد و دماي نمایانگر 10 280 درجه سانتیگراد استفاده شد. هلیم به عنوان گاز حامل با دبی حجمی 2 میلیلیتر در دقیقه استفاده شد.
