بخشی از مقاله
چکیده
شوري خاك یک تهدید بزرگ براي عرضهي مواد غذایی در جهان است، چرا که تجمع املاح در خاك تأثیر بازدارندهایی بر رشد گیاه داشته و باعث کاهش بازده محصولات میشود. باکتريهاي افزایندهي رشد گیاه - Plant growth promoting rhizobacteria - PGPR - - از جمله اکتینومیستها گروهی از باکتري هستند که قادرند موجب افزایش رشد و عملکرد گیاه شوند و به طور پیوسته استفاده از PGPR در کشاورزي در حال افزایش است. این مطالعه با هدف بررسی توان تولید هورمون اکسین توسط اکتینومیستهاي موجود در خاك شور در بخشی از استان مازندران منطقه ران بهشهر انجام گرفت.توان تولید اکسین جدایه در غلظتهاي صفر و 100 میلی گرم در لیتر تریپتوفان مورد بررسی قرار گرفت که به طور میانگین جدایه مورد بررسی با اعمال تریپتوفان، مقدار اکسین بیشتري تولید کرد. نتایج این مطالعه نشان داد که جدایه مورد بررسی توان تولید اکسین را داشت.
کلمات کلیدي: اکتینومیست، باکتري افزاینده رشد گیاه، شوري، تریپتوفان
-1 مقدمه
از مهمترین مشکلات کشاورزي در ایران، شوري اراضی است. مشکل شوري به خاطر زیاد بودن تبخیر از سطح خاك، بارندگی کم، پستی و بلندي زمینها، سنگهاي مادري و آبیاري با کیفیت نامناسب است. عوامل فوق باعث به وجود آمدن شورهزارهاي زیادي-گردیده است - برزگر PGPR . - 1387 بخش کوچکی - %2-5 - از جمعیت باکتريهاي ریشه هستند. این دسته از باکتريها قادرند به طور مستقیم و غیرمستقیم موجب افزایش رشد و عملکرد گیاه شوند - اردکانی و همکاران، . - 2010 اثر مستقیم شامل فراهمی براي گیاهان از طریق تثبیت نیتروژن، فیتوهورمونها - سیتوکینین، جیبرلین - ، کلات کنندهي آهن و فسفات محلول میباشد؛ در حالی که اثر غیرمستقیم رشد گیاهان شامل کنترل زیستی و در نتیجه موجب ترقی رشد گیاه میشود - گوپالاکریشنان و همکاران، . - 2012
در خلال چند دهه گذشته استفاده از PGPR به دلیل بهبود رشد گیاه و کاهش آلودگی ناشی از مصرف کودهاي شیمیایی و آفتکشها، در نظامهاي کشاورزي پایدار در بسیاري از نقاط دنیا رشد چشم گیري داشته است که اکتینومیسیتها با داشتن خصوصیات محرك رشد گیاه نقش پررنگی در این زمینه ایفا میکنند. اکتینومیستها متعلق به گروه وسیع و متنوعی از باکتريهاي گرم مثبت - حمیدا و همکاران، - 2013، هوازي و رشتهایی هستند که نقش اکولوژیکی مهمی در چرخه عناصر غذایی دارند - کوریا و همکاران، . - 2010 اکتینومیستها در محیط زیست، شایع و گسترده بود و بیشتر گونههاي اکتینومیستی، شیمیوارگانوتروف، هوازي و میان خواه بوده و در pH نزدیک به خنثی به طرز بهینهایی رشد میکنند.
اکتیومیستها از جوامع مهم باکتریایی خاك مخصوصا در شرایط نامساعد از جمله تحت تنش خشکی، رطوبت، pH بالا و شوري هستند - التاربیلی و همکاران، . - 2006 بیشترین جنس اکتینومیستهاي خاك به استرپتومایسس - خامنا و همکاران، - 2009 و نوکاردیا تعلق دارد - حمیدا، . - 2013 استرپتومایسس به وسیله تولید سیدروفورها و یا ایندول استیک اسید رشد گیاه را تحریک میکند و همچنین استرپتومایسس به طرز گستردهاي براي کنترل زیستی پاتوژنهاي قارچی خاکزاد به کار رفته است - گوپالاکریشنان و همکاران، . - 2014 اکسینها گروهی از ترکیبات حلقوي هستند که توانایی بهبود رشد گیاه را دارند که سبب آغاز ریشه زنی، جوانه زنی بذر و طویل شدن سلول میشوند.
ایندول استیک اسید1 - IAA - جزء اصلی خانواده اکسین است که بسیاري از فرآیندهاي فیزیولوژیکی مهم از قبیل توسعه و تقسیم سلول، تمایز بافت و پاسخ به نور و جاذبه را کنترل میکند - حمیدا، . - 2013 تریپتوفان یک پیش ماده اولیه براي تشکیل ایندول استیک اسید در گیاهان و میکرواگانیسمها است. در حضور تریپتوفان، میکروبها مقدار IAA و ترکیبات مرتبط بیشتري را تولید میکنند - پاتل و پاتل، . - 2014IAA توسط بسیاري از میکروارگانیسمها از جمله باکتريها، قارچها و جلبکها - هریکریشنان و همکاران، - 2014 و - PGPR مهیت، - 2013 تولید میشود که تاثیرات زیادي بر رشد و توسعه گیاه ایفا میکند - هریکریشنان و همکاران، . - 2014
مطالعهاي در زمینهي تولید ایندول استیک در حضور و عدم حضور ترپپتوفان توسط احمد و همکاران - 2005 - ، انجام شد. نتایج نشان داد در حضور تریپتوفان مقدار تولید اکسین توسط جدایههاي باکتري، افزایش و در مقابل، در نبود تریپتوفان، کاهش یافت. با توجه به اینکه در مورد باکتري تولیدکننده اکسین در خاك شور تحقیقات زیادي انجام نشده است، بنابراین هدف این تحقیق جداسازي اکتینومیست-هاي افزاینده رشد گیاه از خاك شور و اندازه گیري توان تولید اکسین میباشد.
-2 مواد و روش
-1-2 جداسازي اکتینومیست
براي جداسازي اکتینومیستها از محیط کشت آگار کازئین نشاسته 2 - SCA - استفاده شد - جدول . - 1-2 - کومار و همکاران، . - 2012محیط کشت آماده شده در دماي 121 درجه سانتی گراد براي مدت 15 دقیقه سترون شد. پس از کاهش دما براي جلوگیري از رشد قارچها به محیط کشت آنتی بیوتیک نیستاتین افزوده شد - بالاکریشنا و همکاران، . - 2012 سپس 5 گرم خاك ریزوسفري به همراه ریشه به ارلنهاي شامل 90 میلی لیتر آب سترون شده منتقل گردید. مخلوط حاصله به مدت 30 دقیقه بر روي دستگاه شیکر با سرعت 150 دور در دقیقه قرار داده شد و پس آنکه سوسپانسیون چند دقیقه به حالت سکون گذاشته شد به وسیله سمپلر سترون از سوسپانسیون 1 میلی لیتر به لولههاي آزمایش حاوي 9 میلی لیترآب مقطر سترون شده اضافه شد - مقامی و همکاران، . - 1391
رقیق سازي تا حصول 10-4 ادامه یافت، از هر رقت با سمپلر سترون 0/1 میلی لیتر از نمونه به پلیت حاوي SCA مربوط منتقل و نمونه به طور یکنواخت بر سطح آگار پخش شد. پلیتها در دماي 28 درجه سانتی گراد براي مدت 7 تا 14 روز گرما گذاري شدند. پس از گرما گذاري، پلیت ها از نظر تشکیل کلنی اکتینومیست بررسی شدند. کشت خالص از کلنیهاي انتخابی بدست آمد و براي بررسیهاي بیشتر بر روي آگار شیبدار در دماي 4 درجه سانتی گراد نگهداري شدند.
-2-2 تست تحمل شوري سویهها
سویههاي جدا شده از خاك در محیط کشتهاي مختلف، اعم از SCA حاوي سطوح مختلف نمک 0 - ، 50، 100، 200، 600،400،800، - 1000 میلی مولار مورد بررسی قرار گرفتند. پلیتها در دماي 28 - 2 درجه سانتی گراد براي 4 هفته گرما گذاري شدند. پس از ظهور کلنیها، کشت خالص تهیه شد و براي مطالعات بیشتر در دماي 4 درجه سانتی گراد بر روي آگار شیبدار نگهداري شدند - آپنیو و همکاران، . - 2007 سپس به منظور بررسی تولید بیومس در حضور نمک تقریباً 100 میکرولیتر سوسپانسیون اسپور به فلاسک 250 میلی لیتر حاوي 50 میلی لیتر محیط کشت SCA اصلاح شده با غلظتهاي مختلف NaCl منتقل شد. فلاسکها در دماي 28 - 2 درجه سانتی گراد بر روي شیکر قرار گرفتند. سپس بعد از 5-10 روز، مسیلیوم و اسپورها بر روي کاغذ صافی منتقل و وزن خشک آنها اندازه گیري شد - صادقی و کریمی، . - 2012
-3-2 تولید اکسین
-1-3-2 تهیه منحنی استاندارد IAA
مجموعه IAA خالص، 0، 50، 100، 150، 200، 250، 300، 350، 400، 450 میکروگرم در درون 10 میلی لیتر آب مقطر سترون رقیق سازي شد. 1 میلی لیتر از هر رقت برداشته و در درون لوله کوچکی قرار داده شد و سپس 2 میلی لیتر واکنشگر سالکووسکی - Salkowsky - به درون لوله ها اضافه شد. پس از 20 دقیقه رنگهاي رقت IAA به قرمز تغییر شکل داد. جذب رنگ قرمز در حال توسعه با اسپکتروفتومتر در طول موج 535 نانومتر مورد سنجش قرار گرفت. غلظت IAA در کشتها به وسیله یک منحنی کالیبراسیون که از IAA خالص به عنوان یک استاندارد پیروي کننده از آنالیز رگرسیون خطی استفاده میکند، تعین شد.
-2-3-2 آماده سازي واکنشگر سالکووسکی
2 میلی لیتر 0/5 FeCl3 مولار با 98 میلی لیتر اسید پرکلریک %35 مخلوط شد تا معرف توسعه دهنده رنگ آماده سازي شود.
-3-3-2 آماده سازي ال- تریپتوفان
100 میلی گرم از ال تریپتوفان - L-tryptophan - به 50 میلی لیتر آب مقطر افزوده شده و این محلول از میکروفیلتر اتوکلاو شده عبور داده شد.
-4-3-2 تعین رنگ سنجی IAA در جدایههاي اکتینومیست
چدایهها از باکتريهاي ریزوسفر در ارلن مایر 250 میلی لیتر حاوي 50 میلی لیتر محیط کشت نوترینت براث با افزودن ال تریپتوفان2 میلی گرم بر میلی لیتر رشد و پرورش یافتند و اکتینومیستها به مدت 48 ساعت در دماي اتاق و بر روي یک شیکر پرورش یافتند.پس از آن 1/5 میلی لیتر کشت باکتریایی به تیوپ منتقل و به مدت 7 دقیقه با سرعت 5000 بر دور میکروسانتریفیوژ شد. سپس 1میلی لیتر از محلول هر یک ازجدایه به لوله آزمایش وارد شد و با 2 میلی لیتر واکنشگر سالکووسکی مخلوط و درب آن با فویل آلومینیومی بسته شد. پس از 20 دقیقه میزان تولید اکسین به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج 535 نانومتر قرائت گردید. در زمان تغییر رنگ محلول حاوي IAA به قرمز، خوانده میشود. هر نمونه 3 مرتبه تکرار شد - بنت و همکاران، . - 2001
-3 نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس میزان اکسین در اکتینومیست جداشده از خاك شور منطقهي مازندران، ران بهشهر تحت تاثیر سطوح مختلف نمک و پیش مادهي تریپتوفان نشان داد که اختلاف معنی داري بین تریپتوفان و شوري وجود دارد - جدول . - 1-3 نتایج بدست آمده از ارزیابی توان تولید اکسین توسط اکتینومیست در شکل 1-3 نشان داد به طور میانگین جدایه مورد بررسی، توان تولید اکسین را در هر دو شرایط با وجود تریپتوفان و بدون تریپتوفان را داشتند. اما میزان تولید اکسین در شرایط وجود تریپتوفان توسط اکتینومیست بیشتر بود که با یافته هاي مقامی و همکاران - 1390 - و بنت و همکاران - 2001 - مطابقت داشت.
اکتینومیستها اکسین را در حضور یک پیش ماده مناسب مانند تریپتوفان تولید میکنند در این مطالعه اکتینومیست از ریزوسفر گیاه جدا شد، ممکن است مقادیر بالاي تریپتوفان در ترشحات ریشهي گیاه وجود داشته باشد و در نتیجه تولید اکسین توسط اکتینومیست را افزایش دهد. تولید اکسین ممکن است تحت تاثیر pH و محیط کشت نوترینت براث باشد. بیشترین مقدار تولید pH در بازهي 7 تا 7/5 است که در این مطالعه7/3 pH بود. pH اسیدي و قلیایی بالا براي تولید اکسین مناسب نیستند زیرا در این شرایط رشد ضعیفی دارند. pH مناسب براي اکتینومیستها خنثی تا کمی قلیایی است - حمیدا و همکاران، . - 2013
همانطور که گفته شد، تریپتوفان به عنوان یک پیش ساز فیزیولوژي براي تولید اکسین توسط میکروارگانیسمها است زیرا میکروارگانیسمهایی مانند استرپتومایسس، پزودوموناس و باسیلوس قادر به سنتز اکسین با استفاده از تریپتوفان از طریق مسیر ایندول سه پیرویک اسید میباشند. وابستگی معنی داري بین رشد باکتري و تولید اکسین در یافتهها نشان میدهد، کاهش تولید اکسین در مراحل بعد ممکن است به علت آزادسازي تجزیه کنندهي اکسین از قبیل IAA اکسیداز، پراکسیداز توسط باکتري باشد - هریکریشنان و همکاران، . - 2014 همچنین با افزایش غلظت شوري میزان تولید
