بخشی از مقاله
چکیده:
تریپتوفان آمینواسید ضروري در متابولیسم انسان، پیشساز انتقال دهنده عصبی سروتونین، هورمون ملاتونین و ویتامین B3 - نیاسین - میباشد که باید در رژیم غذایی انسان حضور داشته باشد. عدم دسترسی به تریپتوفان سبب افسردگی، پرخاشگري، چاقی و افزایش فشار خون شده و بیشترین مصرف آن در درمان کمخوابی میباشد. بنابراین اغلب بهعنوان ماده اولیه در سنتز شیمیایی داروها مورد استفاده قرار میگیرد. گیاهان و میکروارگانیسمها با دارا بودن آنزیمهاي مؤثر در سنتز این اسیدآمینه، نقش مهمی را در تولید آن برعهده دارند. با افزایش تقاضا براي اسیدآمینه تریپتوفان، تولید آن مانند دیگر اسیدهايآمینه به سه طریق آنزیمی، میکروبی و سنتز شیمیایی انجام میگیرد، که در این میان این اسیدآمینه حیاتی اغلب با کمک باکتريهاي اگزوتروف - auxotroph - یا تغییر یافته ژنتیکی E.coli، کورینه باکتریوم گلوتامیکوم و باسیلوس، با دخالت آنزیم تریپتوفان سنتاز تولید میشود.
در این بررسی رشد باکتري E.coli در محیط حداقل توسط روش رنگ سنجی، بررسی وزن خشک ، میزان تولید پروتئین و مصرف قند مورد سنجش قرار گرفت. همچنین تولید اسیدآمینه تریپتوفان به دو روش کروماتوگرافی کاغذي و رنگ سنجی براساس مصرف ایندول - با استفاده از معرف - Ehrlich مورد بررسی قرار گرفت. بررسی رشد در محیط حداقل بر اساس پارامترهاي مورد بررسی ساعت نهم را بهعنوان انتهاي فاز لگاریتمی نشان داده و تولید اسیدآمینه تریپتوفان در محیط تولید محتوي ایندول و بیوکاتالیزور سلولهاي آزاد E.coli - در انتهاي فاز لگاریتمی - از طریق کروماتوگرافی کاغذي و رنگسنجی مشخص شده است.
کلمات کلیدي: تریپتوفان- تریپتوفان سینتاز- کروماتوگرافی کاغذي- رنگسنجی
مقدمه:
تریپتوفان 1Trp - W - یکی از 20 آمینواسید استاندارد بوده و بهعنوان آمینواسید ضروري است که باید در رژیم غذایی انسان وجود داشته باشد - . - 7 گیاهان و میکروارگانیسمها معمولاً تریپتوفان را از شیکیمات یا آنترانیلاتسنتز می نمایند - . - 8 تراکم بعدي با 2PRPP - فسفوریبوریل پیروفسفات - ، پیروفسفات را تولید میکند، بعد از باز شدن نیمی از حلقه ریبوز، به دنبال کربوکسیلاسیون احیایی، ایندول3 گلیسرین فسفات تولید میشود که به ایندول تبدیل میگردد. در مرحله آخر تریپتوفان سینتاز شکلگیري تریپتوفان از ایندول و آمینواسید سرین را کاتالیز میکند . تولید صنعتی تریپتوفان بیوسنتتیک بوده و بر اساس تخمیر سرین و ایندول با استفاده از باکتریهاي اگزوتروف یا تغییر یافته ژنتیکی E.coli، Corynebacterium glutamicum، Bacillus subtilis وBacillus amyloliquefaciens صورت میگیرد. این واکنش بهوسیله تریپتوفان سینتاز کاتالیز میگردد - . - 2 در بدن انسان این آمینواسید به عنوان واحد ساختمانی سنتز پروتئین، همینطور به عنوان پیشساز بیوشیمیایی در تولید سروتونین، ملاتونین و نیاسین - 11 - عمل میکند .
عدم دسترسی به تریپتوفان سبب افسردگی، پرخاشگري، چاقی و افزایش فشار خون میگردد - . - 5 بیشترین مصرف آن در درمان بیخوابی میباشد - . - 4 بنابراین اغلب تریپتوفان بهعنوان ماده اولیه در سنتز شیمیایی داروها مورد استفاده قرار میگیرد - - 6 و نیز بهطور گسترده در صنایع غذایی کاربرد دارد - . - 3 روشهاي شناخته شده براي تولید آمینواسیدها شامل، سنتز شیمیایی،جداسازي آمینواسیدها از هیدرولیزات اسیدي پروتئینها و فرایندهاي میکروبی میباشد - . - 10فرایندهاي میکروبی خود به دو نوع فرایند تخمیر و سنتز آنزیمی تقسیم میشوند، و مزایاي هر روش بستگی به فاکتورهاي زیادي شامل : فرایندهاي اقتصادي، موقعیت در دسترس بودن مواد خام، اندازه بازار فروش، تنظیمات محیطی و مانند آن دارد. بنابراین روش تولید ترجیحی باتوجه به نوع آمینواسید و نیز زمان و موقعیت متفاوت خواهد بود.
مواد و روشها:
سوش E.coli در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت - . - 9 این سوش بر روي محیط اسلنت LB کشت داده و در دماي 37 0C انکوبه شد. سویه موردنظر بر روي محیط اسلنت کمپلکس وسپس 100 میلیلیتر محیط کمپلکس مایع محتوي، عصاره مخمر، گلوکز و سولفات آمونیوم درpH=7 کشت داده شد. رشد سویه در محیط مینیمال محتوي نمک هاي سیترات سدیم، سولفات منیزیم، فسفات پتاسیم و آمونیوم دي هیدروژن فسفات بههمراه -Lتریپتوفان و ملاس کارخانه قند ارومیه می باشد. این واکنش درpH=7 انجام گرفت و بیوماس سلولی حاصل بهعنوان بیوکاتالیزور به محیط تولید تریپتوفان تلقیح شد.
ترکیبات محیط تولید شامل، بیوماس، ملاس، ایندول، گلوکز و سولفات آمونیوم است. تولید تریپتوفان در ساعتهاي مختلف در این محیط با روش TLC و رنگسنجی با استفاده از معرف Ehrlich مورد بررسی قرار گرفت.در روش TLC از استاندارد تریپتوفان، یک میلیگرم تریپتوفان در 10 میلیلیتر -n بوتانول استفاده شد - . - 1از محلول نینهیدرین، 0.1% - w/v - پودر نینهیدرین در 100 میلیلیتر استون و سیستم حلال شامل -n بوتانول/اسید استیک/آب - 22:13:65 - استفاده شده است . - 13 - در روش اسپکتروفتومتري از معرف پارادي متیل آمینوبنزالدهید براي بررسی واکنش تولید تریپتوفان استفاده شد - . - 12
نتایج و بحث:
با بررسی تغییرات جذب محیط کمپلکس در 620 nm، ساعت ششم بهعنوان انتهاي فاز لگاریتمی درنظر گرفته شد. همچنین بررسی تغییرات جذب، وزن خشک، مصرف قند و تولید پروتئین درمحیط مینیمال تأیید میکند که بعد از 9 ساعت انتهاي فاز رشد لگاریتمی در این باکتري و در این محیط بوده است. در این محیط در حدود 2/47 g در هر 100 میلی لیتر بیوماس به دست آمده است.
