بخشی از مقاله
چکیده
- AID - Activation-induced cytidine deaminase یک آنزیم اختصاصی لنفوسیت های B مسئول هایپرموتاسیون سوماتیک و نوترکیبی تعویض کالس ژن های آنتی بادی در لنفوسیت های B مراکز زایگر در ارگان های لنفوئیدی محیطی می باشد. افزایش بیان نابه جای این آنزیم منجر به موتاسیون در سلول های غیر از لنفوسیت های B و حتی در باکتری Escherichia coli شده است. سیستم های بیانی با دما بر اساس پروموتر های چپ و یا راست باکتریوفاژ المبدا متکی به یک پروموتر تنظیمی قوی هستند و با موفقیت در تولید بسیاری از پروتئین های نوترکیب مورد استفاده قرار گرفته اند.
از آن جاییکه موتاسیون های القایی نیازمند شرایط به شدت تنظیم شده هستند، به نظر می رسد بیان آنزیم AID تحت پروموتر القایی با دمای باکتریوفاژ المبدا منجر به تولید پروتئین های کارامدتر می شود. بنابراین هدف این مطالعه تولید یک سازه mutator تشکیل شده از ژن AID تحت کنترل پروموتر چپ باکتریوفاژ المبدا در باکتری Escherichia coli می باشد. برای دستیابی به این هدف،کلون ژن AID در یک وکتور بیانی القایی با دما که توسط رپرسور حساس به دمای cI857 باکتریوفاژ المبدا تنظیم شده، انجام شد. نتایج حاصل از تعیین توالی، سازه طراحی شده را تایید نمود.
مقدمه
آنزیم AID عضوی از خانواده پروتئینی پلی نوکلئوتید سیتوزین یا دئوکسی سیتوزین دآمینازها می باشد. این آنزیم مسئول القا موتاسیون های رندوم - تصادفی - در مناطق متغیر ژن های آنتی بادی که جایگاه اتصال به آنتی ژن را کد می نمایند، می باشد. مکانسیم این آنزیم هدف قراردادن باز های سیتوزین، دآمیناسیون باز های سیتوزین به یوراسیل و بنابراین تبدیل جفت باز C/G به U/G می باشد - . - 1 این آنزیم در تولید آنتی بادی هایی با میل اتصال باال اهمیت قابل توجهی دارد.
روزها پس از برخورد اولیه با آنتی ژن، آنتی بادی هایی با افزایش میل اتصال ساخته می شوند. این افزایش به دنبال برخورد لنفوسیت های B با آنتی ژن اختصاصی توسط پروسه ای به نام هایپر موتاسیون سوماتیک - SHM - رخ می دهد. پدیده هایپر موتاسیون سوماتیک با بیان آنزیم Activation - AID - induced cytidine deaminase در لنفوسیت های B تحریک شده با آنتی ژن آغاز می گردد - . - 2 بعضی از این موتاسیون های موجب افزایش میل اتصال آنتی بادی ها شده و در نتیجه قدرت - پاسخ - آنتی بادی های حاصله را در خنثی سازی ویروس ها، توکسین ها و غیر فعال کردن ارگانیسم های بیماری زا افزایش می دهد.
مطالعات مختلف بیان آنزیم AID و عملکرد آن را در سلول های مختلف بررسی کرده اند. آنزیم AID در انواعی از سلولها غیر از لنفوسیت های B از جمله فیبروبالست، HEK293T، NIH3T3، مخمر موجب القاء جهش در ژنوم آنها میشود - . - 3 همچنین نقش این آنزیم در ایجاد موتاسیون ژن های مختلف در باکتری اشرشیاکولی - E.coli - بررسی شده است. به صورتیکه در مطالعه ای نشان داد که بیان آنزیم AID در E.coli موجب جهش در هر دو رشته الگو و غیر الگو در ژن مقاومت به ریفامپسین میشود - . - 4
باکتری های mutator عموما در یک یا چند ژن مسئول ترمیم DNA نقص دارند. این باکتری ها کاربرد های مختلفی درآزمایشکاه دارند. از جمله اینکه استفاده از سویه های mutator یکی از روش های جهش زایی تصادفی - Random - mutagenesis می باشد . - 5 - با توجه به بیان ژن AID و ایجاد موتاسیون از طریق آن در باکتری E.coli به نظر می رسد از این آنزیم بتوان جهت تولید یک سویه mutator استفاده کرد.
پروموتر PL ، پروموتر حساس به دمای باکتریوفاژ المبدا می باشد از مزایای این پروموتر عدم نیاز به القاگر های شیمیایی مانند IPTG می باشد. از این سیستم بیانی تنظیم شونده با دما به طور موفقیت آمیز در تولید بسیاری از پروتئین های نوترکیب و پپتیدها با اتکا به پروموتری به خوبی تنظیم شده و قدرتمند و بدون نیاز به محیط های خاص، القاگر های شیمیای سمی یا گران استفاده شده است - . - 6 بنابراین هدف از این مطالعه بیان ژن AID تحت پروموتر حساس به دمای PL می باشد. به دلیل تولید یک سیستم بیانی متفاوت از سیستم های متداول از جمله IPTG و با توجه به اینکه اکثر پالسمید های بیانی حاوی ژن مقاوم به آمپیسیلین هستند، در این مطالعه سازه بیانی ژن AID تحت پروموتر تنظیم شونده با دمای PL و حاوی ژن مقاوم به آنتی بیوتیک تتراسایکلین طراحی شد.
