بخشی از مقاله
مناسب ترین روش برای مهار و محدود کردن سل - - TB واکسیناسیون می باشد. BCG، به عنوان یک واکسن قدیمی برای مقاوم سازی انسان برعلیه TB دارای دو مشکل بنیادی می باشد که عبارتند از: عدم توانایی برای القای مناسب ایمنی در تمام دوران زندگی فرد و طیف وسیع پاسخ به این واکسن. در حال حاضر پروتئین هایی با آنتی ژنیسیته مناسب از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس تخلیص شده اند، که هر کدام می توانند به عنوان گزینه ای مناسب برای ایجاد یک واکسن جدید مطرح باشند. یکی از این پروتئین ها ، DnaK ، چاپرونی با وزن مولکولی 71 کیلو دالتون است که با غلظت بالا در محیط کشت این باکتری یافت می شود. خالص سازی این پروتئین با استفاده از چند مرحله متوالی کروماتوگرافی صورت گرفت. در ابتدا از ستون -Q سفاروز که نوعی ستون تعویض یون می باشد در بافر تریس 50 میلی مولارpH 8/1 و گرادیانی ازغلظت 0 تا 1 مولار کلرید سدیم برای خالص سازی جزیی DnaK استفاده شد . در مرحله دوم فراکشن های حاوی پروتئین از ستون هیدروفوب اکتیل - سفارز و بافر 20 میلی مولار تریس pH 7/5 و غلظت های مختلف و ناپیوسته ای از آمونیوم سولفات که در بازه ی 0 تا %30 اشباع قرار داشتند ، استفاده شد. نمونه های به دست آمده با استفاده از SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفتند و میزان خلوص آن با استفاده از نرم افزار Total lab تخمین زده شد.
مقدمه
امروزه بیماری سل همچنان به عنوان یکی از کهن ترین و مهلک ترین بیماری ها سلامت بشر را تهدید می کند. در حال حاضر اگر چه با استفاده از آنتی بیوتیک های مناسب و استفاده ی همزمان از چند آنتی بیوتیک می توان سیر ایجاد بیماری را مهار نمود، اما براساس آمار های سازمان بهداشت جهانی - WHO - و بر خلاف پیش بینی های انجام شده در برخی مناطق این بیماری همچنان دارای سیری صعودی می باشد. امروزه برخی از سویه های مایکو باکتریوم توبرکلوزیس به صورت یک باکتری بسیار مقاوم به آنتی بیوتیک و یا به شکل یک باکتری فرصت طلب در افرادی که دارای نقص در سیستم ایمنی خود می باشند، باعث ایجاد عفونت های باکتریایی شدید که گاهی حتی به مرگ فرد مبتلا نیز می انجامد، می گردد. براساس گزارش سال 2007 سازمان بهداشت جهانی، در سال 2005 تعداد 8.8 میلیون مورد جدید از ابتلا به سل در جهان گزارش شده که از این میان 7/4 میلیون نفر در آسیا و آفریقا زندگی می کنند. همچنین در این سال 1/6میلیون نفر بر اثر عفونت های حاصل از مایکوباکتریوم درگذشته اند که از این تعداد 195000 مورد از این افراد آلوده به ویروس HIV نیز بوده اند - . - 1
همانند بسیاری دیگر از بیماری های عفونی و باکتریایی مناسب ترین روش برای جلوگیری از ابتلا به این بیماری و محدود نمودن شیوع آن استفاده از واکسن مناسب می باشد. واکسن متداول برای بیماری سل که امروزه نیز همچنان مورد استفاده قرار می گیرد BCG می باشد که گونه ای از مایکو باکتریوم است که در اثر پاساژهای فراوان تضعیف و غیر بیماری زا گشته است. استفاده از واکسن BCG با تمامی مزایا و سابقه استفاده ی طولانی از آن دارای نقایصی نیز می باشد؛ از یک سو این واکسن تنها به عنوان واکسنی مناسب در دوران کودکی بوده و در بالغین دارای اثر ایمنی بخشی مناسب نمی باشد و از سوی دیگر در نقاط مختلف دنیا و افراد متفاوت طیف وسیعی از واکنش به این واکسن قابل مشاهده می باشد، از این رو تحقیقات برای تولید یک واکسن مناسب برای مقابله با این باکتری همچنان به عنوان یکی از اهداف استراتژیک در تحقیقات بالینی موردنظر می باشد. امروزه با توسعه تکنیک های جدید، واکسن های جدید نه بر پایه ی ارگانیسم تضعیف شده بلکه بر پایه ی استفاده از پروتئین های دارای آنتی ژنیسیته بالا طراحی می گردند - 3،. - 2
در همین راستا تا کنون آنتی ژن های متنوعی در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شناسایی شده اند که هر کدام از آنها دارای توانایی مناسب و منحصر به فرد در تحریک سیستم ایمنی سلولی و هومورال می باشند. بسیاری از آنتی ژن های مورد استفاده در ایمنی زایی بر علیه سل جزو پروتئین های ترشحی و یا موجود در محیط کشت این باکتری می باشد که از مهمترین آنها می توان به ESAT-6 و Ag85B اشاره نمود - . - 3 علاوه بر پروتئین های ذکر شده پروتئین های دیگری نیز با آنتی ژنیسیته مناسب در محیط کشت این باکتری شناسایی شد که از میان آنها می توان به DnaK اشاره نمود - . - 4 این مولکول پروتئینی نوعی چاپرون مولکولی با وزن مولکولی 71 کیلودالتون می باشد که دارای نقشی مهم در شکل گیری و انتقال پروتئین ها بوده و دارای تشابه توالی DNA بیش از %50 با DnaK موجود در E.Coli و hsp70 انسانی می باشد. این پروتئین به تنهایی می تواند باعث القای پاسخ در سیستم ایمنی هومورال گردد. همان گونه که ذکر شد این پروتئین یک چاپرون مولکولی با توانایی هیدرولیز ATP و اتصال به دیگر مولکول های پروتئینی می باشد و از آنجا که جزو پروتئین های شوک حرارتی می باشد در حالت استرس حرارتی میزان بیان آن افزایش می یابد. تحقیقات پیشین نشان داده است که میزان بیان بیش از حد این پروتئین باعث افزایش فاگوسیتوز باکتری توسط ماکروفاژ ها می گردد - . - 4
مواد و روش ها
برای خالص سازی پروتئین از محیط کشت 6 هفته ای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سویه - ATCC No.35808,TMC116 - C که در محیط دورسه-هنله کشت داده شده، استفاده شد. در اولین مرحله برای جداسازی DnaK پروتئین های موجود در محیط کشت با استفاده از آمونیوم سولفات رسوب داده شدند. پس از مرحله ی ترسیب برای خارج ساختن آمونیوم سولفات از محیط، پروتیئن های رسوب داده شده در بافر تریس 50 میلی مولار، pH 8/1 دیالیز شدند. در اولین مرحله برای جداسازی جزیی DnaK از ستون -Q سفاروز که نوعی ستون تعویض آنیونی می باشد به همراه بافر تریس 50 میلی مولار، pH 8/1 و گرادیان پیوسته ای از 0 تا 1 مولار کلرید سدیم استفاده شده، نمونه ها جمع آوری و با استفاده از اندازه گیری جذب در 280 نانومتر، تست تعیین غلظت پروتئین براد فورد و الکتروفورز بر روی % 12 SDS PAGE مورد بررسی قرار گرفتند.
در آخرین مرحله و برای خالص سازی نهایی پروتئین از فراکشن شماره ی 23 استفاده شد. در این مرحله پروتئین ها پس از دیالیز علیه بافر تریس 20 میلی مولار،pH 7/5 از ستون اکتیل سفاروز که ستونی هیدروفوب می باشد ، عبور داده شدند و پس از این مرحله 6 بافر مختلف هر کدام به حجم 10 سی سی که شامل تریس 20 میلی مولار ، pH 7.5 با غلظت های نایوسته ای از%30 تا %0 آمونیوم سولفات اشباع بودند از روی ستون عبور داده شد. مجموعه ی نمونه های خارج شده از ستون جمع آوری و با استفاده از اندازه گیری میزان جذب نمونه در طول موج 280 نانومتر و الکتروفورز بر روی SDS PAGE مورد بررسی قرار گرفتند. پروتئین DnaK در نهایت در نمونه ی شماره ی 34 و در 0 اشباع از آمونیوم سولفات از ستون خارج گردید. میزان خلوص نهایی پروتئین DnaK بدست آمده با استفاده از SDS PAGE و نرم افزار توتال لب %93 تخمین زده شد
بحث و نتیجه گیری
برخی از پروتئین ها ی مترشحه از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس دارای خاصیت آنتی ژنیسیته بالایی می باشند و همین خصوصیت آنها را به عنوان یک گزینه ی مناسب برای تحقیقات و در نهایت تولید یک واکسن مناسب بر علیه بیماری سل مطرح می کند. در این میان مولکول پروتئینی DnaK با توانایی مناسب در تحریک سیستم ایمنی هومورال و سلولی سیستم ایمنی و میزان تداخل ایمنی بسیار محدود می تواند به عنوان یک آنتی ژن مناسب در تحقیقات برای تولید یک واکسن موثر برعلیه سل مورد استفاده قرار گیرد. روش تخلیص این پروتئین که به تفصیل بیان گردید روشی بسیار ساده می باشد که توسط آن می توان مقادیر قابل قبولی از این آنتی ژن را در طی مراحلی محدود، با صرفه ی اقتصادی و در مدت زمان اندک تخلیص نمود. با استفاده از داده های به دست آمده می توان چنین بیان نمود که این پروتئین در سطح خود دارای سطح بالایی از آمینو اسیدهایی با بار منفی می باشد. علاوه بر موارد ذکر شده می توان با استفاده از همیار های مناسب که می توانند به شکل متصل یا به صورت محلول به همراه این آنتی ژن مورد استفاده قرار بگیرند، میزان پاسخ ایجاد شده توسط آن را تا حدود بسیار بالایی افزایش داد.
- نمودار شماره ی 1
کروماتوگراف مربوط به بررسی نمونه های به دست آمده از ستون های -Q سفاروزبا استفاده از تست برادفورد - - 595nm و نمونه های خارج شده از ستون اکتیل سفاروز با استفاده از اندازه گیری میزان جذب در .280nm
