بخشی از مقاله
چکیده:
تجاري کردن فراورده هاي تخمیري، مستلزم اقتصادي کردن فرایندها و کاهش هزینه ها است، کاهش قیمت تمام شده محصول نیز با استفاده از محیط کشت ارزانتر امکان پذیر است. هدف از این پژوهش یافتن منابع کربن و نیتروژنی است که علاوه بر افزایش میزان رشد باکتري Pseudomonas fluorescence استرین UTPf61 که یک عامل بیوکنترل براي قارچ Sclerotinia sclerotiorum محسوب می شود از نظر اقتصادي نیز در مقیاس تولید نیمه صنعتی و صنعتی امکان پذیر باشد. در این تحقیق جدایهUTPf61 از میان 40 جدایه بر اساس آزمون هاي هاله بازدارندگی، سیانید هیدروژن، پروتئاز و تاثیر بر روي فاکتور هاي رشدي گیاه آفتابگردان در شرایط گلخانه انتخاب شد.
نرخ رشد این جدایه درهشت محیط کشت مختلف حاوي ملاس و نشاسته به عنوان منابع کربن و عصاره ذرت1 به عنوان منبع اصلی نیتروژن بررسی شد که ملاس محصول فرعی تولید قند از چغندر است و ارزانترین ومتداولترین منبع ساکارز می باشد و عصاره ذرت محصول جانبی کارخانجات استخراج نشاسته از ذرت است و یکی از باارزش ترین ترکیباتی است که به عنوان منبع نیتروزن در صنایع تخمیري مختلف بکار می رود. از میان این هشت محیط کشت، محیط کشت حاوي ملاس، عصاره ذرت بیشترین تاثیر را در افزایش رشد باکتري داشت.
مقدمه:
باکتري هاي آنتاگونیست خصوصا سودوموناس هاي فلورسنس با تولید یکسري متابولیت هاي ضد میکروبی و آنتی بیوتیک، سیانید هیدروژن، سیدروفور، پروتئاز، پدیده رقابت و ... نقش موثري در کنترل بیماریهاي خاکزي دارند. فاکتورهاي محیطی از جمله عواملی هستند که بر روي فعالیت عوامل بیوکنترل موثر می باشند و همچنین در تنظیم بیوسنتز ترکیبات ضد میکروبی نقش مهمی ایفا می کنند. از طرفی تجاري کردن فراورده هاي تخمیري، مستلزم اقتصادي کردن فرایندها و کاهش هزینه ها است، کاهش قیمت تمام شده محصول نیز با استفاده از محیط کشت ارزانتر امکان پذیر است.
کوستا و همکاران - - 1 براي پیدا کردن بهترین منبع کربن که حداکثر بیومس Pantoea agglomerans را با حداقل قیمت ایجاد کند مشخص کردند که کربوهیدراتهاي ارزان قیمتی مثل سوکروز و ملاس حداکثر بیومس را تولید می کنند. طبق بررسی هاي لونا و همکاران - - 6 مشخص شد که بیشترین رشد باکتري باسیلوس در محیط کشت حاوي ملاس به عنوان منبع کربن صورت می گیرد. آیر - - 3 نشان داد که فسفات پپتون و آمونیوم هیدروژن به ترتیب بهترین منابع آلی و غیرآلی نیتروژن می باشند.
همچنین در پژوهشی دیگر مشخص شد که بیشترین سطح تولید پلی بتا هیدروکسی بوتیرات 2توسط برخی گونه هاي باکتري باسیلوس در محیط کشت حاوي پروتئاز پپتون ایجاد می شود - . - 7 از آنجا که آفتابگردان یکی از گونه هاي گیاهی است که به قارچ Sclerotinia sclerotiorum حساس است و هیچ برنامه اي براي گسترش مقاومت به پوسیدگی اسکلروتینیایی در آفتابگردان انجام نشده است و هیچ کنترل شیمیایی موثري براي این بیماري شناخته نشده است - - 8 استفاده از عوامل بیوکنترل علیه این قارچ می تواند موثر باشد.
شواهد نشان می دهد که تلقیح دانه ها با باکتري آنتاگونیست بطور موثري بر روي رشد گیاه بوسیله حفاظت بذور و حفاظت علیه پاتوژن هاي خاکزاد موثر است - . - 4 تعدادي از استرین هاي گونه هاي Pseudomonas fluorescence و P. putida به عنوان عوامل بیوکنترلی قارچ هاي مختلف خاکزاد گزارش شده اند - . - 2 هدف از این پژوهش یافتن منابع کربن و نیتروژنی است که علاوه بر افزایش میزان رشد باکتري Pseudomonas fluorescence استرین UTPf61 که یک عامل بیوکنترل براي قارچ Sclerotinia sclerotiorum محسوب می شود از نظر اقتصادي نیز در مقیاس تولید نیمه صنعتی و صنعتی امکان پذیر باشد.
مواد و روش ها:
-1 جداسازي باکتري: از میان 40 جدایه باکتريP. fluorescence جدایه UTPf61 بر اساس تست هاله بازدارندگی، سیانید هیدروژن، پروتئاز و تاثیر بر روي رشد رویشی در گلخانه انتخاب و براي آزمایش هاي بعدي بکار برده شد.
-2 نشاسته به این دلیل به عنوان منبع کربن استفاده شد که در آزمایشات قبل بهترین جواب را در بین منابع کربن مختلف داده بود؛ سپس منابع ازت آلی و غیرآلی مختلف به این دو محیط بطور جداگانه اضافه شدند که این منابع ازت نیز بهترین نتیجه را در آزمایشات قبلی در پی داشتند و شامل موارد ذیل بودند: سولفات آمونیوم - 2گرم بر لیتر - ، پپتون - 2گرم بر لیتر - و دي آمونیوم هیدروژن فسفات - 2گرم بر لیتر - .
-3 آماده سازي محیط کشت و مایه زنی با سوسپانسیون باکتري: ابتدا درون فلاسک هاي 100 میلی لیتري به میزان 50 میلی لیتر از هر کدام از محیط هاي کشت در 3 تکرار ریخته شد و محیط ها به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شدند. سپس از کشت 24 ساعته باکتري آنتاگونیست غلظت 1×106 سلول باکتري در هر میلی لیتر محاسبه شد و به میزان یک میلی لیتر به هر کدام از فلاسک هاي حاوي محیط کشت استریل، تحت شرایط کاملا استریل اضافه شد. سپس فلاسک ها به مدت 48 ساعت درون شیکر- انکوباتور در دماي 25 درجه سانتیگراد و 100دور در دقیقه قرار گرفتند.
-4 تعیین جمعیت باکتري: رشد باکتریایی بطور مستقیم با اندازه گیري بوسیله اسپکتوفتومتریک با جذب نوري600 1 نانومتر با استفاده از یک اسپکتوفتومتر Ulterospec П و نتایج در قالب آزمایشات فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی مورد تجزیه و تحلیل آماري قرار گرفتند و مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح P≤0.01 انجام شد.
نتایج و بحث:
نتایج حاصل از آنالیز واریانس نشان داد - جدول - 1 که بین منابع مختلف کربن اختلاف معنی داري وجود داشت و ملاس چغندر در سطح احتمال 0.01 درصد اختلاف معنی داري با نشاسته داشت طبق این نتایج منابع ازت در یک سطح عمل کردند و اختلاف معنی داري با شاهد نداشتند همچنین اثر متقابلی بین منابع کربن و ازت وجود نداشت. بر طبق آزمایشات قبل که منابع مختلف کربن بررسی شده بودند مشخص شد که نشاسته بهترین منبع کربن است و حداکثر بیومس در محیط حاوي نشاسته ایجاد می شود، در این آزمایش مقایسه بین محیط کشت حاوي نشاسته و ملاس چغندر قند صورت گرفت و نتایج بدست آمده نشان داد که محیط حاوي ملاس چغندر علاوه بر اینکه ارزانترین ومتداولترین منبع ساکارز می باشد بیشترین میزان بیومس را نیز دارا بود.
بنابراین نوع مواد به کار رفته در محیط کشت ممکن است در میزان جمعیت عامل بیوکنترل میکروبی مفید باشند ولی موادي که براي بهینه سازي یکی از خصوصیات باکتري در فرایند تولید انبوه به کار می رود لزوما با دیگر اهداف آن سازگاري ندارد. در ضمن جزئیات محیط هاي کشت تجاري موجود در برخی کشور هاي توسعه یافته در دسترس نیست و حالت محرمانه دارد. بنابراین وظیفه ماست تا با تحقیق و پژوهش بیشتر در مورد مکمل هاي غذایی و بهبود مراحل فرمانتاسیون، به تکنولوژي تولید انبوهی دست یابیم که از نظر حفظ قدرت حیات عوامل آنتاگونیست بسیار موثر بوده و علاوه بر آن حداقل قیمت را نیز در پی داشته باشند تا در نهایت عامل آنتاگونیست به صورت انبوه و تجاري تولید شده و در اختیار کشاورزان قرار گیرد.
