بخشی از مقاله
چکیده:
رسورسینول یک دايهیدروکسی بنزن میباشد. از این ماده بطور گسترده در تولید داروها، مواد آرایشی و بهداشتی استفاده میشود. این مطالعه به منظور دستیابی به باکتريهاي تجزیه کننده رسورسینول صورت گرفته است. نمونهگیري از رسوبات ساحل مجاور مصب رودخانه سفیدرود انجام شد. باکتريها جداسازي و خالص گردیدند. به منظور سنجش تجزیهکنندگی باکتريها از محیط مینرال فاقد هرگونه منبع کربن استفاده شد. 40ppm رسورسینول بعنوان منبع کربن و انرژي به محیط مینرال اضافه شد و باکتريهاي خالص شده به محیط تلقیح شدند. توانایی تجزیه زیستی باکتريها با استفاده از اسپکتروفتومتر، با اندازهگیري در محدوده طیف فرابنفش-مرئی صورت گرفت. پس از مشخص شدن باکتري تجزیه کننده، استخراج DNA و واکنش PCR با پرایمرهاي رفت و برگشتی H6F و H6R براي بدست آوردن توالی تقریبا کامل ژن 16S rRNA انجام شد. توالی ژن با توالیهاي ثبت شده در پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژي مقایسه شد. بر اساس اطلاعات بدستآمده باکتري مورد نظرPseudomonas sp. شناسایی شد.
کلمات کلیدي: رسورسینول- - Pseudomonas sp. ژن – 16S rRNA تجزیه زیستی- رودخانه سفیدرود
مقدمه:
رسورسینول1 - رسورسین - یک دايهیدروکسی بنزن با فرمول C6H6 - OH - 2 است - . - 12 این ماده از جمله مواد سنتتیک است که از جوشاندن مقدار زیادي رزین - مثل گالبانوم، آسافوتیدا و... - با پتاسیم هیدروکساید و یا با تقطیر عصاره چوب برزیل2 تولید میشود. رسورسینول یک ضدعفونی کننده است و پمادهاي %5-10 آن در درمان بیماريهايمزمن پوستی تجویز میشود. رسورسینول همچنین بعنوان واسط شیمیایی در تولید داروها و سایر ترکیبات آلی، بعنوان ضد شوره در شامپوها، در کرمهاي ضد آفتاب، تولید رنگهاي دي آزو و مواد پلاستیکی کاربرد دارد. رسورسینول در ساختارهاي چند مولکولی شیمیایی بعنوان الگو مورد استفاده قرار میگیرد. گروههاي –OHرسورسینول با مولکول هدف که آنرا در خود جاي داده در موقعیتی مناسب براي واکنش، باند هیدروژنی تشکیل میدهد.
بسیاري از چنین واکنشهایی قادرند بوسیله احیا یا حذف، در حالت جامد نیز انجام شوند. بنابراین استفاده ازمحلولهاي آن براي محیط زیست مضر است. مصرف روزانه رسورسینول روي پوست، اثراتی روي غده تیروئید در حیوانات وانسان دارد - . - 13 مسمومیت حاد با رسورسینول از طریق بلعیدن آن ایجاد میشود که با علایمی همچون استفراغ، اسهال، تهوع، متهموگلوبینیا، مشکلات کبدي، ادم1 ریوي و افسردگی تشخیص داده میشود - . - 11 رسورسینول معمولا از طریق روشهاي معمول همچون فرایندهاي فیزیکی، بیولوژیکی و شیمیایی قادر به حذف شدن از جریانات فاضلاب است. یائو و همکاران از پراکسید هیدروژن بعنوان اکسیدکننده و آنزیمی از باکتري serratia marcescence AB90027 براي حذف ترکیبات فنولی استفاده کردند. تعداد کمی از میکروارگانیسمها، بخصوص باکتريها قادر به تجزیه هوازي رسورسینول میباشند - 3،6،8،. - 10
مواد و روشها:
نمونهگیري از سه منطقه سفید رود، رودخانه تالار و ساحل دریاي خزر که بیشترین میزان آلودگی از آنها گزارش شده بود، صورت گرفت. نمونهگیري از آب رودخانه از مصب یا دهانه رود که تغییراتی در جریانات آب در آن حاصل میشود،صورت گرفت.این محل با استفاده از سایت Google map مکانیابی گردید. نمونههاي آب و رسوب در فالکونهاي 50 میلیلیتري استریل جمعآوري شد. فالکونها در تاریکی و روي یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. کشت اولیه در غلظتهاي مختلف نمک محیط -%0 - Marine agar %1-%0/5 و - %2 و Sea Water Medium انجام گردید. باکتريهاي حاصل جدا و خالصسازي شدند.
از محیطهاي مینرال - BRUNNER - ، محیط - 5 - BLK medium و محیطی داراي KH2PO4 2 gr/l، KCl 1 gr/l، NH4Cl 1.5 gr/l و MgSO4 0.2 gr/l براي تیمارهاي سنجش تجزیهکنندگی باکتريها استفاده شد. به محیطکشتهاي اتوکلاو شده، رسورسینول حل شده در آب مقطر استریل با غلظت نهایی 40 ppm افزوده شد - رسورسینول بهطور کامل در آب حل میشود - . 50 میلی لیتر از محیط تهیه شده به ارلن مایرهاي 250 میلیلیتري منتقل و با 20 مایکرولیتر از سوسپانسیون تازه باکتریایی 24 - ساعت - تلقیح شد. تیمارها در تاریکی، دماي 30 درجه سانتیگراد و با تکان 150 دور در دقیقه انکوبه شدند. محیط کشت بدون باکتري بعنوان شاهد استفاده شد . تمام آزمایشها در 2 تکرار انجام شد. باکتريهایی که قادر به تجزیه رسورسینول بودند با کشت روي محیط جامد Marine Agar جداسازي شدند.
دو شاهد جهت تعیین توانایی تجزیه رسورسینول توسط باکتريها در نظر گرفته شد. جهت سنجش رشد یا عدم رشد باکتري در محیط فاقد منبع کربنی از محیط کشت مینرال فاقد رسورسینول و براي محلول استاندارد از محیط مینرال داراي رسورسینول و بدون باکتري استفاده شد. به محیط شاهد و کلیه تیمارهاي باکتریایی 40 میلیگرم بر لیتر رسورسینول افزوده شد و بعد از 24، 48 و 72 ساعت، 7 روز و در نهایت 30 روز نگهداري باکتريها در دماي 30 درجه سانتیگراد سوسپانسیونهاي سلولی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر Biowave II UV/Visible - WPA - در محدوده طیفی فرا بنفش- نور مرئی طیف سنجی شد. براي شناسایی ژنوتیپی باکتريهاي تجزیه کننده که در محیط جامد جداسازي شدهاند، DNA باکتریایی با روش تغییر یافته کوربین و همکاران2 - 2 - استخراج گردید.
توالی تقریبا کامل ژن 16S rRNA با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR - با پرایمر رفت H6f - 5́-AgA Gtt TgA TC - AC - Tgg CTC AG-3́ - و پرایمربرگشت - H6R - 5́-TAC CTT gTT Agg ACT TCA CC-3́ تکثیر شد. قطعه تکثیر شده با طول 1500 جفت باز بعد از خالصسازي با استفاده از کیت خالصسازي از ژل شرکت Roche، جهت تعیین توالی به شرکت Alpha sequence کالیفرنیا فرستاده شد. توالیها و گرافهاي مربوط به نمونههاي باکتریایی با استفاده از نرم افزار Bio Edit بررسی و آنالیز و با توالیهاي موجود در پایگاه داده NCBI مقایسه شد. نهایتا باکتريهاي تجزیه کننده تعیین هویت گردیدند.
نتایج و بحث:
باکتريها در دو محیط مینرال BRUNNER و - 5 - BLK medium نه تنها در محیط داراي رسورسینول - بعنوان منبع کربن - بلکه در محیط فاقد رسورسینول نیز قادر به رشد بودند. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که این محیطها براي بررسی توانایی تجزیه رسورسینول مناسب نیستند. به منظور کاربرد محیطی مناسب که بیانگر بهترین بازده براي تجزیهکنندگی و استفاده از رسورسینول بهعنوان منبع کربن باشد، محیط مینرالی حاوي 4 ترکیب KH2PO4 2 gr/l، KCl 1 gr/l، NH4Cl 1.5 gr/l و MgSO4 0.2 gr/l بکار برده شد. 30 ایزوله باکتریایی که از نمونههاي آب جدا و خالصسازي شده بودند جهت بررسی توانایی تجزیه رسورسینول در این محیط مینرال کشت شدند.
طی این تیمارها جدایه SM211 به عنوان تجزیهکننده شناسایی گردید. رشد باکتري در فواصل زمانی 24، 48 و 72 ساعت و همچنین 7 روز با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر - - OD600 اندازهگیري شد. با توجه به مطالعات تجزیهاي که در گذشته صورت گرفته، براي بررسی کاملتر توانایی رشد باکتري در محیط کشت مینرال حاوي رسورسینول، میزان رشد باکتري بعد از سپري شدن 30 روز نیز اندازهگیري شد. در این مورد میزان جذب در محدوده طیف فرابنفش-مرئی اندازهگیري شد که نتایج حاصل در جدول شماره 1 آورده شده است. در شکل شماره 1 نمودارهاي حاصل نشان داده شدهاند.
گرافهاي موجود در شکل 1 تجزیه شدن رسورسینول را تحت تیمارهاي بکار رفته نشان میدهد. شناسایی مولکولی باکتري پس از استخراج DNA و انجام واکنش PCR، با پرایمرهاي رفت و برگشتی H6F و H6R براي تکثیر ژن 16S rRNA حاصل شد. نتیجه توالییابی با طول 1395 جفت باز در بانک ژن مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژي1 با شماره JF899245 ثبت گردید. بعد از مقایسه توالی ژن 16SrRNA این جدایه با توالیهاي معتبر ثبت شده در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژي، باکتري مورد نظر Pseudomonas sp. شناسایی شد. با توجه به رهاسازي پسابهاي کارخانجات توانایی این باکتري در تجزیه رسورسینول میتواند ما را در حذف آلایندههاي محیطی ناشی از فعالیت کارخانجات و مراکز صنعتی یاري رساند.
