بخشی از مقاله
چکیده:
آروماتیکهاي سولفاته - دترجنتهاي سخت - موادي غیر قابل تجزیه بوده و از معضلات زیستمحیطی محسوب میشوند. هدف این مطالعه بدست آوردن میکروارگانیسمهاي داراي توانایی تجزیه لاورانت اسید - Laurent’s acid - ، بعنوان یک نفتالن سولفونات بوده است. نمونهگیري از عمق 25 سانتیمتري مصب رودخانه سفیدرود انجام شد. باکتريها جداسازي و خالص گردیدند. به منظور سنجش تجزیهکنندگی باکتريها از محیط مینرال فاقد هرگونه منبع کربنی استفاده شد.
40ppm لاورانت اسید بعنوان منبع کربن و انرژي به محیط مینرال اضافه شد و باکتريهاي خالص شده به محیط تلقیح شدند. توانایی تجزیه زیستی باکتريها با استفاده از اسپکتروفتومتر و با اندازهگیري در محدوده طیف فرابنفش-مرئی صورت گرفت. لاورانت اسید در محلول استاندارد در طول موج 230 نانومترو -5آمینو -1-نفتول بعنوان محصول تجزیه لاورانت اسید در طول موج 330 نانومتر داراي جذب میباشند. پس از مشخص شدن باکتري تجزیه کننده، استخراج DNA و واکنش PCR با پرایمرهاي H6F و H6R براي بدست آوردن توالی تقریبا کامل ژن 16S rRNA انجام شد. توالی ژن با توالیهاي ثبت شده در پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژي مقایسه شد. بر اساس اطلاعات بدستآمده باکتري مورد نظر Pseudomonas sp. شناسایی شد.
مقدمه:
لاورانت اسید1 با نام شیمیایی -5آمینو-1نفتالن سولفونیک اسید از آروماتیکهاي سولفاته و دترجنتهاي سخت میباشد. این ترکیب جزء اولین موادي است که بعنوان یک مسئله عمومی در زمینه مواد زنوبیوتیک2 غیرقابل تجزیه به آن توجه شده است - . - 3 در دهه1840 با اینکه بیشتر رنگها منشا طبیعی داشتند این رنگ بصورت مصنوعی و از تبدیل فنول به پیکریک اسید تولید گردید. نفتالن سولفوناتها و آنالوگهاي جایگزین آنها بعنوان مواد غیر قابل تجزیه مطرح شدهاند - - 1 و خصوصیت زنوبیوتیک گروههاي سولفونیکی آروماتیکها شناخته شده است - . - 9 بریلون و همکاران - 1981 - 3 با انتخاب در کشتهاي مداوم، ارگانیسمهایی با توانایی معدنی کردن کمی -1نفتالن سولفونات - NS-1 - و -2نفتالن سولفونات - NS-2 - را جدا کردند - . - 2
ساکوتا و همکاران - 1978 - 4، اوه و همکاران - 1986 - 5 و نورتمن و همکاران - 1986 - 6 طی گزارشات خود نشان دادند که تیمارهاي پیاپی منجر به جداسازي ارگانیسمهایی میگردد که قادر به استفاده از -2آمینو--1نفتالن سولفونات 12 - ، - 11 و شماري از نفتالن سولفوناتهاي جایگزین دیگر - 10 - بعنوان منبع کربن میباشند. کوك و همکاران - 1982 - 1 نشان دادند که باکتريها میتوانند از پرومترین [N,N´-bis - 1-methylethyl - -6-methylthio-1,3,5-triazine-2,4-diamine] بعنوان تنها منبع سولفور براي رشد استفاده کنند - 4،. - 5 زورر و همکاران - 1987 - 2 نشان دادند که باکتريهایی همچون Arthrobacter sp. توانایی دسولفاته و تجزیه کردن سولفانوآروماتیکها را دارا میباشند . - 13 -
مواد و روشها:
سه منطقه سفید رود، رودخانه تالار و ساحل دریاي خزر که بیشترین میزان آلودگی از آنها گزارش شده بود، جهت نمونهگیري انتخاب گردیدند. به علت تغییرات جریان آب در مصب رودخانهها، این مکان بعنوان محل نمونهگیري در نظر گرفته شد. این محل با استفاده از سایت Google map مکانیابی گردید. نمونههاي آب و رسوب در فالکونهاي 50 میلیلیتري استریل جمعآوري شد. فالکونها در تاریکی و روي یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. کشت اولیه در غلظتهاي مختلف نمک محیط %1-% 0/5-%0 - Marine Agar و - %2 و Sea Water Medium انجام گردید. باکتريهاي حاصل جدا و خالصسازي شدند.
از محیطهاي مینرال BRUNNER، محیط - 8 - BLK medium و محیطی داراي KH2PO 4 2 gr/l، KCl 1 gr/l، NH4Cl 1.5 gr/l و MgSO4 0.2 gr/l براي تیمارهاي سنجش تجزیهکنندگی باکتريها استفاده شد. به محیطکشتهاي اتوکلاو شده، لاورانت اسید حل شده در اتانول 96% مرك با غلظت نهایی 40 ppm افزوده شد. 50 میلی لیتر از محیط تهیه شده به ارلن مایرهاي 250 میلیلیتري منتقل و با 20 مایکرولیتر از سوسپانسیون تازه باکتریایی 24 - ساعت - تلقیح شد. تیمارها در تاریکی، دماي 30 درجه سانتیگراد و با تکان 150 دور در دقیقه نگهداري شدند. محیط کشت بدون باکتري بعنوان شاهد استفاده شد. تمام آزمایشها در 2 تکرار انجام شد. باکتريهایی که قادر به تجزیه لاورانت اسید بودند با کشت روي محیط Marine Agar جداسازي شدند.
براي تعیین توانایی تجزیه لاورانت اسید توسط باکتريها دو شاهد تهیه شد. جهت سنجش رشد یا عدم رشد باکتري در محیط فاقد منبع کربنی از محیط کشت مینرال فاقد رنگ لاورانت اسید و براي محلول استاندارد از محیط مینرال داراي رنگ لاورانت اسید و بدون باکتري استفاده شد. به محیط شاهد و کلیه تیمارهاي باکتریایی 40 میلیگرم بر لیتر رنگ لاورانت اسید افزوده شد و بعد از 24، 48 و 72 ساعت، 7 روز و در نهایت 30 روز نگهداري باکتريها در دماي 30 درجه سانتیگراد سوسپانسیونهاي سلولی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر Biowave II UV/Visible - WPA - در محدوده طیفی فرا بنفش تا نور مرئی طیف سنجی شد.
براي شناسایی ژنوتیپی باکتريهاي تجزیه کننده جداسازي شده، DNA باکتریایی با روش تغییر یافته کوربین و همکاران3 استخراج گردید - . - 6 توالی تقریبا کامل ژن 16S rRNA با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR - با پرایمر رفت H6f و پرایمربرگشت تکثیر شد. قطعه تکثیر شده با طول 1500 جفت باز بعد از خالصسازي با استفاده از کیت خالصسازي از ژل شرکت Roche، جهت
تعیین توالی به شرکت کالیفرنیا فرستاده شد. توالیها و گرافهاي مربوط به نمونههاي باکتریایی با استفاده از نرم افزار BioEdit بررسی و آنالیز شد . توالی ژن 16srRNA در باکتريهاي جداسازي شده با توالیهاي موجود در پایگاه داده NCBI مقایسه شدند و باکتريها تعیین هویت گردید.
نتایج و بحث:
در محیطهاي مینرال مدیوم BRUNNER و - 8 - BLK medium باکتريها نه تنها در محیطهاي داراي لاورانت اسید بعنوان منبع کربن بلکه در محیط فاقد لاورانت اسید نیز قادر به رشد بودند. ازاینرو این محیطها براي بررسی توانایی تجزیه لاورانت اسید مناسب نبودند. جهت دستیابی به محیطی مناسب که بیانگر بهترین بازده براي تجزیهکنندگی و استفاده از لاورانت اسید بهعنوان منبع کربن باشد، از محیط مینرال حاوي 4 ترکیب KH2 PO4 2 gr/l، KCl 1 gr/l، NH4Cl 1.5 gr/l و MgSO4 0.2 gr/l استفاده شد. 30 ایزوله باکتریایی خالصسازي شده از آب در این محیط مینرال براي بررسی توانایی تجزیه لاورانت اسید کشت شدند. جدایه SM221 به عنوان تجزیهکننده شناسایی گردید.
میزان رشد باکتري در فواصل زمانی 24، 48 و 72 ساعت و همچنین 7 روز با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر - - OD600 اندازهگیري شد. براي بررسی کاملتر توانایی رشد باکتري در محیط کشت مینرال حاوي رنگ لاورانت اسید میزان رشد باکتري بعد از سپري شدن 30 روز نیز اندازهگیري شد. نتایج بدستآمده در جدول شماره 1 آورده شده است. زورر و همکاران1 طی اندازهگیري با فاز معکوس کروماتوگرافی مایع با فشار بالا2 نشان دادند که لاورانت اسید در طول موج 230 نانومتر جذب دارد و محصول حاصل از تجزیه - دسولفاته شدن - آن -5آمینو--1نفتول، داراي جذب در طول موج 330 نانومتر میباشد - . - 7 میزان جذب در این طولموجها پس از 30 روز اندازهگیري شد. در شکل شماره 1 نمودارهاي حاصل نشان داده شدهاند.
نمونه شاهد - فاقد باکتري و داراي لاورانت اسید - داراي بیشترین جذب در طول موج 230 نانومتر بود. در محیط مینرال تلقیح شده با جدایه SM221 پیک جذبی در 330 نانومتر مربوط به واکنش دسولفاته شدن لاورانت اسید، و محصول این فرایند، -5آمینو--1نفتول مشاهده شد. جذب در این طول موج نمایانگر توانایی این جدایه در تجزیه لاورانت اسید میباشد. شناسایی مولکولی باکتري پس از استخراج DNA و انجام واکنش PCR با پرایمرهاي H6F و H6R براي تکثیر ژن 16S rRNA انجام شد.
