بخشی از مقاله
ارزیابی فعالیت بیو کنترلی قارچ تریکودرما هارزیانوم بر روی فوزاریوم سولانی در میوه سیب پس از برداشت
چکیده :
سابقه و هدف: سیب و فراورده های آن نقش عمده ای در تغذیه انسان و اقتصاد کشاورزی بازی می کنند. بیماری های بعد از برداشت سیب که عمدتا توسط قارچ ها ایجاد میشوند خسارت قابل توجهی را یه این محصول از نظر کمی و کیفی وارد می کند. و در دهه های اخیر باقیمانده سموم بر روی میوه ها باعث ایجاد نگرانی هایی در جوامع علمی شده است.و در حال حاضر کنترل بیولوژیک به عنوان یک روش جایگزین استفاده از سموم مطرح شده است. لذا نظر به اهمیت اقتصادی و بهداشتی بیماری های بعد از برداشت سیب، هدف از انجام این تحقیق بررسی امکان کنترل بیولوژیکی قارچ های عامل فساد فوزاریوم توسط قارچ تریکودرما در میوه سیب پس از برداشت می باشد.
روش بررسی: نمونه های سیب به صورت تصادفی از سرد خانه های شهر آمل جمع آوری گردید.قارچ تریکودرما هارزیانوم و قارچ عامل بیماری فوزاریوم سولانی از موسسه گیاهپزشکی کشور تهیه گردید. اثر آنتاگونیستی تریکودرما هارزیانوم بر روی قارچ عامل بیماری سیب در شرایط آزمایشگاه نظیر، کشت روی لام ، مایکوپارازیتیسم، کشت متقابل و آزمون متابولیت فرار مورد آزمایش قرار گرفت. و در آزمایش انباری سیب، زخمهایی بر روی سیب ایجاد شد و 40 میکرولیتر از آنتاگونیست تریکودرما با غلظت 107 سلول در میلی لیتر و پس از 24 ساعت 20 میلی لیتر از سوسپانسیون های قارچ های بیمارگر به صورت مجزا با غلظت 105 مایع زنی شدند. سیب های مایع زنی شده در دمای 20 و 5 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
یافته ها:بررسی میکروسکوپی ناحیه تقابل ریسه های آنتاگونیست و بیمارگر ها مشخص کرد که تریکودرما پس از نفود به سلول هیفی بیمارگر ، درون آنها پیشروی کرده و موجب تخریب سلول هیف بیمارگر ها شد. در آزمون کشت متقابل میزان کاهش رشد برای فوزاریوم 59/24 درصد بود. و در تست متابولیت فرار برای فوزاریوم 72/58 درصد مساحت پرگنه قارچ بیمارگر را کاهش داد. در مساحت لکه ها در روی سیب در دمای 5 درجه سانتیگراد برای فوزاریوم0/ 10 سانتی متر مربع در مقایسه با 1/8 سانتی متر مربع در شاهد کاهش را نشان داد. و مساحت لکه ها در روی سیب در دمای 20درجه سانتیگراد برای فوزاریوم11/33سانتی متر مربع در مقایسه با 18/08 سانتی متر مربع در شاهد کاهش را نشان داد.
1
نتیجه گیری: آنتاگونیست تریکودرما هارزیانوم علیه کپک قهوه ای قارچ فوزاریوم در هر دو دما 20 و 5 درجه سانتیگراد موثر بود. آنالیزهای آماری با استفاده از نرم افزار Spss و با اندازه گیری های در سطح احتمال (P<0/05) انجام گرفت و مقایسه میانگین ها با استفاده از روش آزمون چند دامنه ای دانکن مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.
کلمات کلیدی: بیوکنترل، ،تریکودرما،میوه سیب،پس از برداشت، فوزاریوم.
مقدمه :
همانند دیگر جانوران، ما انسان ها همیشه برای ایمن کردن سهم خود در اکوسیستمی که اشغال کرده ایم پیکار می کنیم. جانوران شکار کننده بزرگ احتمالا تهدید کننده اصلی برای انسان های ابتدائی بودند اما بزودی که انسان ها در کشتزارها ساکن شدند علف های هرز، حشرات و میکرو ارگانیسم ها رقابت کننده های اصلی با انسان ها شدند و محصولات، غذا و ذخیره های غذایی آنها را نابود ساختند.
در ابتدا تکنولوژی های ناکافی برای جنگیدن با این رقابت کننده ها وجود داشت و آفت های با عمر دراز و طولانی مدت، قحطی و گرسنگی و خشکسالی خود را نمایان می ساختند ولی در راستای پیشرفت های علمی و کارهای توسعه ای بعدی در قرن گذشته روش های پیشرفته و مؤثر برای کنترل آفت های گیاهی بکار گرفته شد و بیشترین روش مؤثر برای کنترل آفت های گیاهی کاربرد آفت کش بود که در راستای مقاومت واریته های گیاهی بود. تولید آفت کش یک تجارت پر سود شده و غذاهای با کیفیت بالا و مازاد تولید شده است و گرسنگی و آفت به مدت طولانی رایج نبوده و جمعیت انسان ها به سرعت و با نسبت ثابت افزایش یافت (بنبو و همکاران .(1999
آسیب بعد از برداشت میوه ها اساساً از طریق قارچ کش های شیمیایی بعد از برداشت کاهش یافته و یا از طریق مدیریت های عملی برای کاهش تلقیح یا مدیریت مؤثر در سیستم های ذخیره سرما (نگهداری محصولات درجه حرارت پائین تر از زمان برداشت تا مصرف
که عموماً رشد پاتوژن ها را کاهش می دهد) به درجه کمتر رسیده است.
خسارت پس از برداشت میوه ها و سبزیجات بین 10 تا 40 درصد برآورد گردیده است که این میزان بسته به تکنولوژی های به کار رفته در کارخانه های بسته بندی و انبار متفاوت است (ویلسون و ویسنیووزکی، 1994؛ آراس و آروئه، .(1999 چنین خسارت هایی عمدتاً مربوط به قارچ های بیماریزا می باشد (ویلسون و ویسنیوزکی، .(1989 این قارچ ها معمولا از طریق زخم های ایجاد شده در طول
برداشت میوه حمله می کنند (ورو و همکاران، .(2002
برای کنترل بیماریهای قارچی از قارچ کش هایی مانند ایمازالیل که یکی از قارچ کش های سنتتیک است نیز استفاده می شود (نونس و همکاران، .(2001 ولی استفاده از این قارچ کش ها باعث ایجاد و گسترش جدایه های مقاوم بیمارگر به این قارچ کش ها و نیز تأثیرات سوء این ترکیبات روی سلامت مصرف کنندگان و محیط زیست می گردد، لذا ضرورت دستیابی به روش های جایگزین برای کنترل شیمیایی را طلب می کند (آهو ن. منش، .(1379
2
استفاده از قارچ کش های شیمیایی بعد از برداشت به علت تکامل پاتوژن های مقاوم به بسیاری از قارچ کش های کلیدی کمتر دیده شده است و فقدان قارچ کش های جایگزین و نگرانی های عمومی از اینکه آفت کش ها برای سلامتی انسان و محیط مضر هستند، استفاده از قارچ کش های شیمیایی را کاهش داده است. بنابراین روش های جایگزین برای کنترل بیماری های بعد از برداشت ضرورتاً مورد نیازشده است. (کاپدویل و همکاران 2002 ، دکون و همکاران 1997، ایپولیتو وهمکاران 2000، ماری و همکاران 2003، مسیح و همکاران 2000، ویلسون و همکاران .( 1985
در سال های اخیر کنترل بیولوژیکی پس از برداشت با استفاده از آنتاگونیست های میکروبی به عنوان یک روش جایگزین مناسب برای قارچ کش های صنعتی مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته است، خصوصا کنترل بیولوژیکی عوامل بیماری زا در مراحل پس ازبرداشت به لحاظ سهولت آغشته سازی میوه ها با آنتاگونیست ها می تواند کاربردی باشد .
عوامل میکروبی مورد استفاده در کنترل بیولوژیک شامل قارچ ها، باکتری ها، ویروس ها و مخمر ها می باشند که در مورد باکتری ها و قارچ ها کارهای زیادی در زمینه کنترل پاتوژن های گیاهی انجام شده است و بعضی از محصولات بیو کنترلی مشتق شده از آنها تحت نام های تجارتی مختلف در بعضی از کشور ها به فروش می رسد. ویروس ها عمده فعالیت آنها در کنترل آفت های گیاهی با منشا حشرات است و کار های زیادی هم در این زمینه انجام شده است اما به علت محدودیت های ویروس ها و نیازمندی آنها به میزبانشان کمتر در کنترل بیماری های گیاهی با عوامل قارچی استفاده شدند.
آنتاگونیست های قارچی همانند تریکودرما هارزیانوم به طور مؤثر برای کنترل بسیاری از عوامل بیماری زای گیاهی از جمله شبه گونه های فوزاریوم، بوتریتیس و ریزوکتونیا به کار برده می شوند (کانی و لاورن، 1998؛ فراول، 1998؛ باتا، 2004؛ صالح پور و همکاران، .( 2005
مواد و روش ها:
تهیه میکروارگانیسم های فعال و سیب مورد آزمایش
بدین منظور سویه های استاندارد قارچی تریکودرما هارزیانوم (IRAN 1833 ac)، و فوراریوم سولانی (IRAN 174 ac(،از موسسه گیاه پزشکی کشور به صورت کشت فعال تهیه شدو در این آزمایش از میوه های سالم و بدون زخم رقم زرد دماوند ازسردخانه شهرستان آمل تهیه شده بود استفاده شد
بررسی نقاط تقاطع میسیلیوم های قارچ آنتاگونیست و بیماری زا به صورت میکروسکوپی(آزمون کلنیزاسیون)
به منظور مشاهده نحوه ارتباط ریسه های آنتاگونیست با بیمارگر آزمونی به شرح زیر اجرا شد.لایه نازکی از محیط PDA داخل تشتک های پتری حاوی لام استریل تهیه گردید سپس دیسک های 5 میلی متری از حاشیه فعال پرگنه های قارچی 3 روزه بیمارگر
3
وآنتاگونیست در 2 طرف لام پوشیده شده با PDA در تشتک پتری کشت شدند. تشتک ها به به مدت 3 روز در دمای 28 درجه و در تاریکی نگه داری شدند پس از سپری شدن زمان، توقف و برخورد ریسه های آنتاگونیست و بیمارگر در سطح لام و محل طلاقی ریسه ها در زیر میکروسکوپ به دقت مورد مطالعه قرار گرفت.این آزمون با 3 تکرار انجام شد.(یلدا واصبی (1390
شکل-1 آزمون کلنیزاسیون
آزمون اثبات بیماری زایی:
ابتدا برای تهیه زاد مایه قارچ های عامل بیماری زیر هود سترون از کشت خالص هر یک از قارچ ها با لوپ استریل مقداری اسپور برداشته و به طور جداگانه به تشتک پتری های حاوی محیط PDA منتقل شد و پس از 7 روز که قارچ ها به میزان لازم تولید اسپور کردند از آنها جهت آلوده سازی میوه ها استفاده شد. به این ترتیب که با لوپ استریل مقداری اسپور برداشته و به 10 میلی لیتر آب مقطر استریل حاوی %5درصد توئین 20 افزوده شد. و سوسپانسیون حاصل به کمک لام هماسیتومتر به غلظت 105 اسپور در هر میلی لیتر رسید. که این غلظت حالت معمول و توصیه شده در آزمایش های پس از برداشت است.(ملکوقلین و همکاران(1990 به منظور مایه زنی ، زاد مایه قارچ های بیمارگر به سطح سیب های رقم زرد دماوند که همگی سالم و فاقد هر گونه عارضه فیزیولوژیک بودند استفاده گردید. برای ضد عفونی سطحی میوه ها به مدت 1 دقیقه در هیپوکلریت سدیم % 0/1 غوطه ور شده و سپس به مدت 30 ثانیه با اتانول %70 ضد عفونی گردیدند. در نهایت میوه ها 3 بار با آب مقطر سترون شست وشو داده شدند. (اعتباریان و همکاران.(2005 سپس روی هر میوه سه زخم به قطر 3 میلی متر و عمق 3 میلی متر با فواصل مساوی از دم ایجاد گردید. به محل زخم 20 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپور به غلظت 105 اسپور در هر میلی لیتر مایع زنی شد. میوه ها بر روی سینی مقوایی و در کیسه های پلاستیکی قرار گرفتندو درون کیسه ها با آب مقطر اسپری شده و مرطوب گردید. پس از 10 روز نگه داری در انکوباتور در دمای 25 درجه سانتیگراد قطر لکه های ایجاد شده روی میوه ها مورد انداره گیری قرار گرفت و مساحت آنها محاسبه شد.در تیمار شاهد از آب مقطر استریل استفاده شد. آزمایش مذکور دارای 2تیمار، شاهد سالم و تیمار آلوده به فوزاریوم در 3 تکرار بود.
4
ارزیابی قدرت آنتاگونیستی تریکودرما روی قارچ های عامل بیماری فوزاریوم در سیب در محیط آزمایشگاه در آزمون کشت متقابل
این آزمون بر اساس روش( دنیس و وبستر(1971 انجام شد. ابتدا هر تشتک پتری به کمک ماژیک به دو قسمت مساوی تقسیم شد. سپس درون هر تشتک پتری به میزان 15 میلی لیتر از محیط کشت PDAریخته شد. پس از جامد شدن محیط ابتدا در یک نیمه از تشتک پتری در فاصله 1 سانتیمتری از لبه آن قرصی از محیط کشت جوان قارچ بیمارگر(2روزه) قرارداده شد. سپس 48 ساعت بعد از گدشتن پلاک قارچ عامل بیماری5mm از کشت 3 روزه آنتاگونیست را در طرف مقابل قارچ عامل بیماری کشت داده شد. سپس تشتک ها در در 25 درجه سانتیگراد به مدت 16 روز نگه داری شده و قطر قارچ های عامل بیماری بعد از گدشت این مدت اندازه گیری شد و سپس مساحت پرگنه قارچ عامل بیماری محاسبه شد. در شاهد تنها قارچ عامل بیماری کشت داده شد و به جای قرص تریکودرما یک قرص 5mm از PDA قرار داده شد.
درصد کاهش رشد مسیلیوم قارچ مطابق فرمول زیر برای هر یک از جدایه ها محاسبه گردید.(اعتباریان و همکاران (2005
n=(a – b)/a×100
=n درصد بازدارندگی از رشد عامل بیماری
=a مساحت پرگنه عامل بیماری در تشتک پتری شاهد
=b مساحت پرگنه عامل بیماری در تشتک پتری بیمار
ای آزمون درقالب طرح کاملا تصادفی در2 تیمار و3 تکرار برای هر تیمار انجام شد.
آزمون تولید مواد فرّار ضد قارچی توسط جدایه های آنتاگونیست
این آزمون مطابق روش تابع بردبار و همکاران2008 انجام شددر تشتک های حاوی محیط PDA قرصی از قارچ آنتاگونیست (محیط کشت 6 روزه (| به قطر 1 سانتیمتر با اسکالپل برش زده و در وسط این محیط کشت قرار داده. سپس در تشتک پتری دیگر حاوی محیط PDA قرصی از قارچ بیماری زا فوزاریوم(محیط کشت 6 روزه) به قطر 1 سانتی متر در وسط این محیط کشت به صورت جداگانه قرار داده شد. سپس در کنار شعله و در شرایط سترون تشتک های حاوی قارچ عامل بیماری وآنتاگونیست روی هم قرار داده شد و لبه های آنها به کمک پارافیلم کاملاً پوشانده شد. بعد از 19 روز قطر پرگنه های قارچ اندازه گیری، سپس مساحت آنها محاسبه گردید و طبق فرمول ذکر شده در بالا درصد کاهش رشد میسلیومی قارچ به دست آمد. (تابع بردبار و همکاران ، .(2008
روش مایه زنی به میوه های سیب به وسیله ی سوسپانسیون قارچ آنتاگونیست و قارچ عامل بیمارگراز طریق ×زخم در دمای 20 و 5 درجه سانتیگراد در دو آزمایش جداگانه
5
رقم های سیب زرد جهت انجام آزمایش همان طور که ذکر شد از سردخانه آمل تهیه شد. سیب های انتخابی بدون هر گونه زخم، لهیدگی و یا سوراخ بودند. سیب ها ابتدا کاملا با آب شسته شدند و بعد همان طور که ( دراثبات بیماریزایی)توضیح داده شده است ضد عفونی شدند. سپس توسط یک میخ استریل 3 سوراخ به قطرهای3 میلی متر وعمق 3 میلی متر در3 نقطه از هر سیب به فاصله مساوی از دم ایجاد شد. پس از این مرحله 20 میکرو لیتر از سوسپانسیون قارچ آنتاگونیست با غلظت 1× 107 سلول در میلی لیتر، که با استفاده از لام هماسیتومتر تعیین شد، به هر چاهک از سیب مایه زنی شد.
پس از 2 ساعت 20 میکرولیتر از سوسپانسیون 105 کنیدی در میلی لیتر قارچ عامل بیماری به داخل سوراخ های تیمار شده با سوسپانسیون تریکودرما مایه زنی شد. و سپس سیب های تیمار شده روی سینی های1 مقوایی قرار گرفته و به درون کیسه های پلاستیکی منتقل شدند. با اسپری کردن آب مقطر استریل به درون کیسه ها رطوبت بالا2 در داخل آنها در حد 95 درصد نگهداری شد. برای هر تیمار 3 تکرار در نظر گرفته شد که هر تکرار شامل یک میوه و هر میوه دارای 3 سوراخ بود. بعد از طی دوره نگهداری زخم ها از نظر ایجاد پوسیدگی بررسی شد. و در دمای 5 درجه سانتیگراد درصد وقوع آلودگی محاسبه شد. .(ورو و همکاران (2002 (یزدی صمدی و همکاران .(1376
جدول -1 نحوه ترکیب تیمار های مختلف در مورد اثر تریکودرما در کاهش رشد لکه های ایجاد شده در اثر قارچ فوزاریوم بر روی سیب در دمای 20 و 5 درجه سانتی گراد به ترتیب پس از 15 و 50 روز
(توضیح :آزمایش 20و 5 درجه سانتیگراد دو ازمایش جداگانه می باشد ولی ترکیب تیمار ها در هر دو دما یکسان است
= F.فوزاریوم سولانی و = T.hتریکودرما هارزیانوم)
بررسی اثر تریکودرما در کنترل فوزاریوم در سیب در دمای 20 درجه سانتیگراد به روش غوطه ورسازی در سوسپانسیون:
6
میوه ها همانطور که توضیح داده شد ضد عفونی شدند و با استفاده از یک میخ استریل سوراخ های به عمق 3 میلی متر عمق و 3 میلی متر قطر در 3 نقطه از سیب با فواصل مساوی از دم ایجاد گردید. سپس مدت 30 ثانیه در سوسپانسیون 107 کنیدی در میلی لیتر از جدایه قارچ تریکودرما غوطه ور شدند.پس از حدود 2 ساعت 20 میکرولیتر از از سوسپانسیون 105 کنیدی در میلی لیتر قارچ عامل بیماری به درون هر زخم به صورت جداگانه افزوده شد. در شاهد از آب مقطر سترون به جای سوسپانسیون آنتاگونیست استفاده شد، سپس میوه های تیمار شده روی سینی مقوایی قرار گرفته وبه درون کیسه پلاستیکی منتقل شدند. و با اسپری کردن آب به داخل آن رطوبت در حد %95 نگه د اشته شد. درب کیسه ها بسته شد. کیسه ها به مدت 18 روز در دمای 20 درجه سانتی گراد نگه داری شدند. برای هر تیمار 3 تکرار در نظر گرفته شد. هر تکرار شامل 1 میوه و هر میوه دارای 3 سوراخ بود. بعد از طی دوره نگهداری زخم ها از نظر ایجاد پوسیدگی بررسی شده و قطر لکه ها اندازه گیری و مساحت آنها محاسبه شد.در شاهد به جای آنتگونیست از آب مقطر استریل استفاده شد. (یزدی صمدی و همکاران .(1376
بررسی اثر آنتاگونیستی غلظت های مختلف آنتاگونیست 108)،107 ، 106،( 105
×در کنترل بیماری کپک سیب که عامل آن قارچ فوزاریوم سولانی است در شرایط دمایی 20 درجه سانتی گراد
در این آزمایش ابتدا چاهک هایی همانطور که گفته شد روی سیب ها ایجاد شد. سپس 20 میکرو لیتر از سوسپانسیون تریکودرما تهیه شد. با این تفاوت که غلظت های مختلف 105 ،106،107و 108 سلول در میلی لیتر به دست آمد. آنتاگونیستی که در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفت باغلظت های مذکور به داخل هر چاهک مایه زنی شد، 24 ساعت بعد 20 میکرو لیتر سوسپانسیون فوزاریوم105 در هر میلی لیتر داخل هر چاهک مایه زنی شد و سیب ها در ظروف یکبار مصرف قرار داده شدند و سپس در دمای 20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند (تیان و همکاران، .(2002
این آزمایش نیز به صورت طرح کاملا تصادفی و با 5تیمار انجام شد و هر تیمار شامل 3 تکرار بود. این آزمایش به مدت 14 روز طول کشید و در روز چهاردهم قطر لکه ها اندازه گیری شد .
تجزیه وتحلیل آماری: برای تجزیه آماری داده ها، از نرم افزار Spss در سطح احتمال 0/05) )استفاده شدو نمودارها با
استفاده از نرم افزار EXCELرسم گردیده است.
بحث و نتیجه گیری:
خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی فوزاریوم
در محیط کشت PDA (سیب زمینی دکستروز آگار) تولید ریسه های هوایی می کند که معمولا سفید با هاله ای مایل به بنفش، صورتی یا نارنجی می باشد (اگریوس، .(1389 میکرو کنیدی ها اغلب تک سلولی(گاهی دو سلولی)، صاف یا خمیده، تخم مرغی شکل و
7
روی فیالیدهای جانبی یا فیالیدهای تولید شده از کنیدیفورهای جانبی کوتاه تولید می شوند. فیالیدها از نوع منو فیالید هستند. ماکرو کنیدی ها داسی شکل، دارای 3-5 دیواره با دیواره ای نازک در هنگام بلوغ و روی فیالیدهای انشعاب یافته از هیف تولید می شوند.
کلامیدوسپورها یک تا دو سلولی با دیواره ضخیم؛ میانی یا انتهایی و روی انشعابات جانبی کوتاه به صورت تکی، جفتی یا زنجیره ای و توسط بیش تر جدایه ها در محیط کشت تولید می شوند (آون، 1956؛ بوث ، 1971؛ نیلسون و همکاران، .( 1983 این قارچ به سرعت در محیط کشت PDA رشد می کند و میسیلوم های سفید و اسپوردوکیوم های نارنجی رنگ تولید می کند. ماکروکنیدی ها با یک تا چهار دیواره عرضی مشاهده می شوند.
شکل-2به ترتیب از چپ خصوصیات میکروسکوپی و ماکروسکوپی فوزاریوم
خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی تریکودرما هارزیانوم
از لحاظ ماکروسکوپی، رنگ پرگنه جدایه های تریکودرما هارزیانوم روی محیط کشت به رنگ سبز تیره است. در بررسی های میکروسکوپی، دارای ریسه ها و شکل غیر جنسی(کنیدیوم و کنیدیفور) مشابه با جنس پنی سیلیوم بودند
