بخشی از مقاله
چکیده مقدمه:
نگهداری قطعات تازه میوه ها و سبزیجات بسیار دشوار است، زیرا بافتهای آنها ممکن است آسانتر از محصولات دست نخورده در معرض تهاجم باکتریهای عامل فساد قرار بگیرند. باکتری Alicyclobacillus acidoterr estris مهمترین باکتری عامل فساد آبمیوهها میباشد. به همین دلیل استفاده از روشهای مناسب برای حذف این باکتری از آبمیوه مورد توجه خاص قرار گرفته است . استفاده از فاژ یا تولیدات فاژی در محصولات غذایی اخیرا برای کنترل باکتریهای مواد غذایی به طور صنعتی مورد توجه قرار گرفته است. هدف از این پژوهش جداسازی باکتریوفاژ اختصاصی باکتری Alicyclobacillus acidoterrestris از خاک برای جلوگیری از فساد آب میوه میباشد.
روش کار: نمونههای جمع آوری شده از خاک اطراف درختان کنار - سدر - پس از سانتریفیوژ و فیلتر شدن برای جستجوی فاژ مورد بررسی قرار گرفتند. باکتری مورد نظر در محیط کشت - Alicyclobacillus Acidoterrestris Broth - AAB تکثیر داده شد و از آن غلظت نیم مک فارلند تهیه شد. باکتری قبلا از آب میوه جداسازی و توسط روشهای بیوشیمایی تشخیص و توسط روش مولکولی تایید شده بود. با اضافه کردن مقدار مشخصی از نمونه های محیطی اجازه تکثیر فاژ در محیط واجد باکتری داده شد. پس از آن محیط سانتریفیوژ شد تا باکتری رسوب کند. مایع رویی که منبع فاژ است فیلتر شد. این مایع خالص فاژ با روش آگار دولایه جهت بررسی تشکیل پلاک مورد آزمایش قرار گرفت. پلاکهای تشکیل شده از لحاظ شکل و اندازه مورد بررسی قرار گرفتند.
یافته ها: وجود باکتریوفاژها در مایع فیلتر شده با استفاده از مشاهده تشکیل پلاک مورد تایید قرار گرفت. بدین ترتیب از نمونه خاک اطراف درخت کنار باکتریوفاژ مقاوم به دمای بالا و اسیدیته پایین جداسازی شد. نتیجه گیری: در این پژوهش وجود باکتریوفاژ اختصاصی باکتری A.acidoterrestris جداسازی شد. از باکتریوفاژهای یافت شده میتوان برای حذف این باکتری از آبمیوهها استفاده نمود. پایداری این باکتریوفاژها در آبمیوهها، اختصاصیت و عدم صدمه به کیفیت آبمیوه از جمله مزایای استفاده از این روش نسبت به سایر فرآیندهای پاستوریزاسیون میباشد و می توان از آن استفاده کرد.
کلید واژه: Alicyclobacillus acidoterrestris، فساد آبمیوه، باکتریوفاژ
مقدمه
باکتریوفاژها ویروسهای باکتریایی هستند که فقط میزبان خاص خود را آلوده میکنند و در آن تکثیر مییابند. اختصاصی بودن میزبان به طور کلی در سطح سویه، گونه و یا به ندرت در سطح جنس میباشد .با استفاده از این ویژگی میتوان باکتریهای فساد مواد غذایی را مورد هدف فاژ قرار داد. استفاده از باکتریوفاژ در درمان بیماریهای عفونی بعد از کشف باکتریوفاژها توسط Twort و DSHerelle مورد توجه قرار گرفت. با وجود آن که تلاشهای اولیه با موفقیتهایی همراه بود ولی با ظهور آنتی بیوتیکها تحقیقات بر روی روش فاژ درمانی متوقف گردید. اما اخیرا بدلیل مقاوم شدن باکتریهای بیماریزا به آنتی بیوتیکها توجه بیشتری به فاژ درمانی شده است.
استفاده از فاژها برای حذف پاتوژنها از مواد غذایی بسیار مهم میباشد. این امر به ویژه برای پاتوژنهای باکتریایی مثل لیستریا، که پس از ورود به بدن میزبان، به عنوان پاتوژنهای درون سلولی رفتار میکنند بسیار حائز اهمیت میباشد. زیرا این پاتوژنها پس از ورود به بدن میزبان توسط سیستم ایمنی بدن و یا حتی تجویز فاژ در فرد مبتلا به لیستریوز قابل شناسایی و حذف نمیباشند در حالی که در مواد غذایی به راحتی با استفاده از فاژها قابل شناسایی و حذف میباشند. استفاده از فاژها برای مواد غذایی با قوانین سادهتری همراه بوده است به طوری که توسط FAO چندین مجوز استفاده از فاژها در مواد غذایی صادر شده است . - 1 - یکی از مزیتهای خاص باکتریوفاژ در تولیدات تازه، عدم صدمه زدن آنها به طبیعت است . بدلیل اختصاصیت بالای باکتریوفاژها برای میزبانهای خود، در درمان بیماریهای غذایی از مخلوط باکتریوفاژهای اختصاصی باکتریهای خاص مواد غذایی استفاده میشود. بهعلاوه فعالیتهای سینرژیسمی در کاربرد مخلوط فاژیهای مختلف مشاهده شده است. میان باکتریوفاژها و باکتریوسینها نیز فعالیت سینرژیسم مشاهده شده است .
در همین راستا محصولات Intralytix که شامل مخلوطهای مختلف است تولید شده است . در اوایل دهه 90 میلادی به دنبال موج گرمای بیسابقه در اروپا مقادیر زیادی آبمیوه دچار فساد با منشا باکتری آلیسایکلو باسیلوس شد که توجه اروپاییها به این باکتری را بیشتر جلب نمود، به طوری که سایر کشورهای جهان نیز به این موضوع علاقمند گردیدند. از آنجایی که رشد این باکتری بر خلاف بیشتر باکتریهای مواد غذایی، ایجاد گاز نمینماید، لذا از ظاهر بستهبندی آبمیوه و مشاهده تورم در آن نمیتوان به فساد و آلودگی آب میوه پی برد 2 - و. - 3 انجمن بین المللی فرآوریکنندگان مواد غذایی در سال 1998 بیان داشتهاند که 35 درصد فسادهای گزارش شده در آبمیوهها ناشی از فساد باکتریهای اسپوردار اسید دوست است و از آنجایی که به جز این باکتری سایر میکروارگانیسمهای رایج در آبمیوهها و محصولات اسیدی دارای مقاومت دمایی پایینتری هستند، اخیرا از این باکتری به عنوان باکتری هدف در این محصولات یاد میشود. این باکتری جزء باکتری های بیماریزا نمیباشد ولی فساد ایجاد شده توسط این باکتری خسارتهای اقتصادی فراوانی به دنبال خواهد داشت.
محققان از تکنیکهای پاستوریزاسیون فراوانی برای حذف این باکتری از آب میوه استفاده نمودهاند که از آن جمله میتوان به Yamazakia و همکاران - 2000 - با استفاده از nisin، Baysal و همکاران - 2010 - با استفاده از گرادیانت ولتاژ و دما، Casas و همکاران - - 2012 با استفاده از فشار بالای CO2 نام برد که همگی دارای اثرات منفی بر روی رنگ ماده غذایی، قیمت نسبتا بالا و محدودیتهای فراوان برای جلوگیری از صدمه دیدن مواد غذایی میباشند و مهمتر از همه موارد ذکر شده، نداشتن اثرات دائمی میباشد 4 - و5و. - 6 هدف از این پژوهش پیدا کردن باکتریوفاژ اختصاصی این باکتری از خاک اطراف درختان کنار در شهرستان اهواز که متوسط دمای آن بالاست، میباشد.
مواد و روش ها
به دلیل اینکه باکتری Alicyclobacillus acidoterrestris، باکتری خاکزی میباشد و بهینه رشد آن در محیط های اسیدی با متوسط دمایی 40-50 درجه سانتی گراد میباشد، لذا باکتریوفاژ آن نیز باید از چنین محیطهایی جداسازی گردد. خاک شهرستان اهواز به دلیل داشتن متوسط دمایی بالا و خاک زیر درختان کنار - سدر - به دلیل میوههایی که معمولا زیر آن میریزد و تخمیر می شوند محیط اسیدی است و لذا محیط مناسبی برای انجام این پژوهش میباشد. نمونههای خاک از عمق 5 سانتیمتری برداشته شد و در ظروف استریل به آزمایشگاه منتقل گردید. در آزمایشگاه خاک مورد نظر پس از اضافه کردن حجم مناسب آب مقطر، خوب مخلوط شد تا به طور کامل حل شود.
سپس این محلول از صافی شنی عبور داده شد تا ذرات درشت آن گرفته شود. پس از آن از صافی کاغذی رد شد تا ذرات معلق بیشتری از مخلوط گرفته شود. مایع حاصله برای اولین مرحله غنی سازی درون ارلنهای استریل ریخته شد و به آن 5 میلیلیتر از کشت معادل نیم مک فارلند از باکتری Alicyclobacillus acidoterrestris اضافه شد. باکتری قبلا از آب میوه جداسازی وتوسط روش های بیوشیمایی تشخیص و با روش مولکولی تایید شده بود. همچنین به آن 100 میلیلیتر آب سیب استریل اضافه شد و در گرماخانه با دمای 43 درجه سانتی گراد و با شیک 110 rpm به مدت 3 شبانه روز قرار داده شد. در مرحله بعد محیط کشت درون فالکونهای استریل ریخته شد و در دور 9000 rpm به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید .
از این مرحله به بعد تمامی فرآیندها برای جلوگیری از آلودگی در زیر هود بیولوژیک و کنار شعله انجام پذیرفت. مایع رویی محلول از فیلترهای 0/45 میکرومتری عبور داده شد تا ذرات ریز معلق و باکتریها حذف شوند. سپس مایع رویی مجددا با فیلتر های 0/22 میکرومتری فیلتر در دمای 4 درجه سانتی گراد برای انجام مراحل بعدی نگهداری شد. در مرحله بعد 1 میلیلیتر مایع فیلتر شده با 1 میلیلیتر از براث حاوی باکتری در دوره رشد نیم مک فارلند مخلوط و به 100 میلیلیتر محیط کشت - Alicyclobacillus acidoterrestris Broth - AAB تازه انتقال داده شده و به منظور غنی سازی مجدد برای یک شبانه روز در دمای 43 درجه سانتی گراد با دور 110 rpm انکوبه شد. بعد از گذشت زمان 24 ساعت محتوی درون ارلن توسط فیلترهای 0/22 میکرومتر فیلتر گردید و مایع حاصله درون یخچال با دمای4 درجه سانتی گراد نگهداری شد.
لازم به ذکر است به دلیل اینکه مدارکی دال بر مقاومت باکتریوفاژ مورد نظر به کلروفرم وجود نداشت از کلروفورم استفاده نشد. در این مرحله، از تکنیک آگار دولایه برای بررسی وجود باکتریوفاژ و تشکیل پلاک استفاده گردید. در تکنیک آگار دولایه، لایه اول دارای میزان % 2 آگار و لایه دوم حاوی سافت آگار - 0/82 درصد آگار - میباشد. ابتدا به دلیل مشخص نبودن تعداد باکتریوفاژ در مایع فیلتر شده، مقادیر 0/5 و 1 میلیلیتر از آن به طور جداگانه به 3 میلیلیتر سافت آگار به همراه 500 میکرولیتر باکتری در مرحله رشد نیم مک فارلند اضافه شد و سریعا ورتکس و برروی لایه اول پخش گردید و پس از چند دقیقه در دمای 43 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه گردید. پلاکهای حاصل - شکل .1الف - با پیپت پاستور جمع آوری شده و درون میکروتیوبهای حاوی 1 میلیلیتر MgCL2 مخلوط گردید.
به میکروتیوبهای حاوی پلاکهای محیط کشت میزان %1 نمک NaCL در غلظت نهایی 1 مولار اضافه گردید و به مدت 1 ساعت درون یخ قرار داده شد . سپس این میکروتیوبها با دور 13000 rpm برای مدت 15 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. مایع رویی به میکروتیوب دیگری انتقال داده شد و توسط فیلتر 0/22 میکرومتر فیلتر و به دور از نور در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. برای بار دوم با تکنیک آگار میزانهای 50 میکرولیتر از مایع حاوی فاژ به 400 میکرولیتر از باکتری در فاز نیم مک فارلند و 3 میلیلیتر سافت آگار AAM اضافه، ورتکس و بر روی لایه اول پخش گردید. پلیتها در دمای 43 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه گردید و پلاکهای تک حاصله از لحاظ مورفولوژیک مورد بررسی قرار گرفتند.
یافته ها
از میان روشهای مورد استفاده برای تایید وجود باکتریوفاژ برای باکتری A. acidoterrestris از قبیل تکنیک آگار دولایه، کشت چمنی باکتری به همراه باکتریوفاژ و تکنیک قطره چکان، بهترین تکنیک برای تایید وجود این باکتری، تکنیک آگار دولایه می باشد. پلاکهای تشکیل شده در شکل .1 - ب - قابل مشاهده میباشد . همانطور که از تصاویر پیداست باکتریوفاژ مورد نظر دارای پلاکهای تک متوسط از لحاظ اندازه میباشد . این باکتریوفاژ از خاک با اسیدیته زیر 6 جداسازی شده است و در طی مراحل این پژوهش باکتریوفاژها در محیط کشت AAM دمای 43 درجه سانتی گراد و اسیدیته کمتر از 5 توانایی لیز باکتری را داشتند . این موضوع نشان دهنده آن است که باکتریوفاژ جداسازی شده برای این باکتری، به دمای 43 -45 درجه سانتی گراد و اسیدیته پایین5/5-5/3 مقاوم میباشد.
نتیجه گیری
در این پژوهش باکتریوفاژ اختصاصی باکتری Alicyclobacillus acidoterrestris جداسازی گردید. با توجه به اینکه مراحل کشت و جداسازی این فاژ در درمای نسبتا بالا - 43 درجه سانتی گراد - و محیط اسیدی آبمیوه بوده میتوان چنین نتیجهگیری کرد که این فاژ مقاومت نسبی به دما و pH اسیدی دارد و به راحتی میتوان از این فاژ برای حذف این باکتری استفاده کرد. از جمله برتریهایی که فاژ برای حذف باکتریهای عامل فساد نسبت به دیگر روشها دارند این است که فاژ کاملا اختصاصی باکتری است و فقط توانایی لیز باکتری اختصاصی خود را دارد . بنابراین برای دیگر باکتری ها و یا سلولهای یوکاریوتی هیچ گونه تمایلی ندارند. توانایی آلوده کردن آنها را ندارند و در نتیجه صدمهای هم به آنها وارد نمیکنند. لذا با این روش میتوان باکتریهای عامل فساد که با فرآیندهای پاستوریزاسیون از بین نمیروند را حذف کرد.
