بخشی از مقاله
کلونينگ و بيان ژن آنزيم پني سيلين آسيلاز از باکتري Arthrobacter viscosus در Escherichia coli
چکيده
پني سيلين آسيلاز (پني سيلين آميداز يا ١١ .١. ٥ .٣ PAC; EC) آنزيمي کليدي است که در توليد صنعتي آنتي بيوتيک هاي نيمه سنتتيک بتا لاکتام نقش دارد. اين آنزيم واکنش تبديل پني سيلين G (بنزيل پني سيلين ) را به APA-٦ و PAA از طريق هيدروليز زنجير آسيل جانبي کاتاليز مي کند. نکته حائز اهميت در مورد اين آنزيم انجام واکنش به صورت دو طرفه با دو ويژگي هيدرولازي و ترنسفرازي است . اين تحقيق با هدف کلون و بيان ژن پني سيلين G آسيلاز از باکتري A.viscosus در E. coli به منظور رسيدن به افزايش سطح بيان انجام گرديد. پس از تکثير ژن pac از ژنوم A.viscosus، محصول PCR در وکتور بياني (+)b٢٦-pET طوري کلون شد که (xHis tag٦) موجود در انتهاي MCS نيز بيان شود. بعد از تعيين توالي سکانس کلون شده، کلونهاي مثبت بر اساس ايجاد هاله در سلولهاي Serratia marcescens حساس به پني سيلين G غربال شد. به علاوه SDS-PAGE و وسترن بلات با آنتي بادي مونوکلونال عليه توالي شش هيستيدين انتهايي ، پردازش اتوکاتاليتيکي را در سيتوپلاسم E. coli تأييد کرد. نتايج اين تحقيق ، توانايي سويه ميزباني را در بيان ژن pac متعلق به باکتري گرم مثبت نشان داد. به علاوه، نتايج نشان داد پروموتور T7 و القاء آن بوسيله IPTG براي افزايش سطح بيان آنزيم پني سيلين آسيلاز متعلق به A.viscosus در ميزبان coli .E مناسب است .
واژه هاي کليدي : Arthrobacter viscosus ، پني سيلين آسيلاز، بيان پروتئينهاي نوترکيب
مقدمه
آنزيم پني سيلين آسيلاز (١١ .١. ٥ .٣ PAC; EC) آنزيم مهمي در صنعت داروسازي است و از نظر ميزان توليد بعد از آنزيم گلوکز ايزومراز در رده دوم قرار دارد (١، ٥ و١٠). پني سيلين آسيلاز (Penicillin acylase) در صنعت داروسازي جهت توليد آنتي بيوتيکهاي نيمه سنتتيک خانواده بتا لاکتام استفاده مي شود. مولکول پني سيلين توسط اين آنزيم به (APA-6) و يک زنجيره جانبي شکسته مي شود. اختلاف پني سيلين هاي مختلف در واقع به علت متفاوت بودن زنجيره هاي جانبي آنها است (٢). از جمله پني سيلين هاي نيمه سنتتيک آموکسي سيلين ، آمپي سيلين و اکساسيلين را مي توان نام برد. فعاليت پني سيلين آسيلاز در تعداد زيادي از ميکروارگانيسم ها از جمله باکتريها، قارچها و مخمرها ديده شده است (٣، ١١ و١٤).
باکتريهاي گرم منفي مانند Escherichia coli وAlcaligenes feacalis اين پروتئين را در فضاي پري پلاسميک ذخيره کرده در حالي که باکتريهاي گرم مثبت مانند Arthrobacter viscosus و Bacillus megaterium آن را به خارج ترشح مي کنند (٨ و٩). اگرچه نقش پني سيلين آسيلاز در باکتريها مشخص نيست ، اما به نظر مي رسد در تجزيه منابع کربني حاوي فنيل استيل نقش دارد (١٣). نحوه پردازش اين پروتئين همانند پري پروهورمون هاي (preprohormones) پروتئيني پستانداران است که در پروکاريوت ها نادر است . پني سيلين G آسيلاز در فرم بالغ ، پروتئيني است هتروديمر، شامل يک زيرواحد کوچک α و يک زيرواحد بزرگ β که از پردازش اتوکاتاليتيکي پلي پپتيد پيش ساز ساخته مي شود. در سال ١٩٩٤ سکانس ژن کدکننده pac در باکتري Arthrobacter ١٥٢٩٤ viscosus ATCC تعيين شد. ژن pac در اين ميکروارگانيسم شامل ٢٤٠٦ نوکلئوتيد با محتواي ژنتيکي 37G+C درصد مي باشد. اين سکانس ، پلي پپتيد پيش سازي (preproPAC) با وزن ملکولي kDa ٩٢ (٨٠٢ اسيدآمينه ) را کد مي کند که ٢٦ اسيدآمينه اول آن متعلق به سيگنال پپتيد (signal peptide) بوده و زيرواحد α و β بوسيله يک پپتيد جداکننده (spacer peptide) از هم جدا مي شوند. زيرواحد α شامل ٢٠٨ اسيدآمينه با وزن ملکولي kDa ٢٤.٣ و زيرواحد β شامل ٥٣٧ اسيدآمينه با وزن ملکولي kDa ٦١.٤ مي باشد (٧ و ٨). پس از انجام پردازشهاي اتوپروتئوليتيکي و حذف سيگنال پپتيد، فرم پيش سازproPAC با وزن ملکولي kDa ٨٩ ساخته مي شود و در نهايت با حذف پپتيد جدا کننده و اتصال دو زيرواحد بوسيله پيوندهاي غيرکوالانت ، PAC بالغ با وزن ملکولي kDa ٨٥.٧ ايجاد مي شود (٨ و ٩). در تنها گزارش مربوط به کلونينگ ژن pac از A.viscosus، اين ژن بطور اختصاصي جدا نشده است بلکه قطعات ژني مختلفي از DNA کروموزومي (gene library) با استفاده از يک آنزيم برش دهنده، که فاقد جايگاه برش در ژن pac باشد، تهيه و کلون گرديده است . سپس کلونها از نظر توليد PAC غربال شدند. رايج ترين روش کلونينگ اين ژن استفاده از پلاسميدهاي چند نسخه اي (plasmid vectors multicopy) است . با توجه به اهميت اين آنزيم در صنعت داروسازي و عدم توليد آن در داخل کشور، در تحقيق حاضر اقدام به کلونينگ ژن آنزيم پني سيلين آسيلاز از باکتري A.viscosus و سپس بيان آن در سيستم E. coli گرديد.
مواد و روشها
باکتري حاوي ژن پني سيلين G آسيلاز به نام Arthrobacter viscosus با شماره ٢٠١٥٩.DSM NO از کشور آلمان تهيه شد. همچنين باکتري Serratia marcescens ATCC٢٧١٧٧ از طرف دکتر C. Perry Chou از دانشگاه Waterloo کشورکانادا هديه داده شد. در اين تحقيق از باکتري E. coli به عنوان ميزبان کلونينگ و ميزبان بياني استفاده گرديد.
استخراج DNA ژنومي Arthrobacter viscosus
ابتدا يک کلوني در ml ٥ از محيط کشت (LB(Luria-Bertani مايع در دماي ٣٧ درجه سانتي گراد و دور rpm ٢٠٠ به مدت ١٨ ساعت گرماگذاري گرديد. ml1.5 از کشت شبانه مذکور با دور در دماي ٤ درجه سانتي گراد به مدت ١٥ دقيقه سانتريفيوژ و رسوب داده شد و به رسوب سلولي μl٦٠٠ محلول ليزکننده تازه (محلول آبي حاوي ٣ ميليگرم ليزوزيم ،١٠ ميکروگرم RNase و EDTA١٠٠ ميکرومول) اضافه و در دماي ٣٧ درجه سانتي گراد به مدت ٣٠ دقيقه انکوبه شد. سپس μl٢٥ ١٠ درصد SDS اضافه و در دماي ٥٠ درجه سانتي گراد به مدت ١٠ دقيقه انکوبه گرديد. در مرحله بعد μl٦٠٠ فنل اشباع شده اضافه و به آرامي مخلوط شد.
مخلوط حاصل در (g ×١٢٦٣٣) rpm ١٥٠٠٠ و دماي ٤ درجه سانتي گراد به مدت ٥ دقيقه سانتريفيوژ گرديد. μl ٤٠٠ از مايع رويي به ميکروتيوب جديد منتقل شد. به منظور خالص سازي DNA استخراج شده μl ٤٠٠ مخلوط کلروفرم- ايزوآميل الکل (١:٢٤) اضافه و به آهستگي با هم مخلوط و مجددا به مدت ٥ دقيقه با سرعت rpm ١٥٠٠٠ در دماي اتاق سانتريفيوژ گرديد. μl ٢٠٠ از مايع رويي به ميکروتيوب جديد منتقل شد. به اندازه ٠.١ حجم محلول، استات سديم ٣ مولار (٥.٢ pH) و ٢ حجم اتانول ٩٥ درصد به آن اضافه و با وارونه نمودن محتويات لوله به آرامي مخلوط شد. محلول به مدت ١ ساعت دردماي ٢٠- درجه سانتي گراد قرار داده شد. سپس محلول به مدت ٥ دقيقه با دور rpm ١٥٠٠٠ در دماي ٤ درجه سانتي گراد سانتريفيوژ گرديد. براي حذف نمکهاي اضافي به رسوب حاصل μl ٤٠٠ اتانول ٧٠ درصد اضافه شد و پس از مخلوط نمودن به مدت ١٠ دقيقه روي يخ قرار داده شد. سپس به مدت ٥ دقيقه در دور rpm ١٥٠٠٠ سانتريفيوژ و مايع رويي توسط سمپلر خارج شد. پس از تبخير کامل اتانول، رسوب حاصل در 30μl TE bufferحل و تا زمان استفاده در دماي٢٠- درجه سانتي گراد نگهداري گرديد.
تکنيک DNA نوترکيب
پس از تهيه توالي ژن پني سيلين آسيلاز از دو پرايمر Avis-F و Avis-R براي دو انتهاي اين ژن براساس توالي موجود (NCBI،L04471) طراحي گرديد. پرايمر Avis-F و Avi-R به ترتيب داراي جايگاه برش براي آنزيمهاي محدودالاثر NdeI و SalI مي باشند.
براي تکثير ژن pac از DNA ژنومي استخراج شده به عنوان DNA الگو استفاده شد. آنزيم استفاده شده براي تکثير Pfu DNA Polymerase (از شرکت Fermentase)
بوده که داراي خاصيت اگزونوکلئازيي '٥ →'٣ (-Proof reading) مي باشد. پس از انجام PCR و تکثير ژن مورد نظر، محصول PCR توسط High Pure PCR Purification Kit (شرکت Roche) طبق دستور العمل شرکت سازنده خالص گرديد و در وکتور که با آنزيم EcoRV خطي گرديده بود، طبق روش ذيل کلون شد. واکنش اتصال (Ligation) بين پلاسميد خطي شده و محصول PCR در دماي C١٦ به مدت ١٦ ساعت با کمک آنزيم DNA ligase T٤ (شرکت Roche) صورت گرفت . محصول واکنش اتصال با روش شوک حرارتي به داخل سلولهاي مستعد ...DH٥ منتقل گرديد. پلاسميد نوترکيب حاصل pGEM-pac نامگذاري شد. تعدادي کلني سفيد حاصل جهت بررسي پلاسميد نوترکيب همراه با يک کلني آبي بعنوان کنترل انتخاب و بر روي محيط LB مايع حاوي آمپي سيلين کشت داده شد. DNA پلاسميدي باکتريها به روش ليز قليايي استخراج و بر روي ژل آگارز ١ درصد الکتروفورز گرديد. DNA پلاسميدي را که نسبت به کنترل (پلاسميد pGEM) وزن مولکولي بالاتر داشت را انتخاب و با روشهاي PCR و برش آنزيمي با آنزيم BstXI (شرکت Roche) مورد بررسي قرار گرفت . پس از تأييد صحت کلونينگ به منظور بررسي بيان اين آنزيم ، ژن pac بوسيله برش با دو آنزيم NdeI و SalI از وکتور نوترکيب pGEM-pac جدا گرديده و خالص شد. پلاسميد (Novagen) (+b)٢٦-pET نيز با همين دو آنزيم خطي گرديد تا انتهاي چسبنده (Sticky ends) قطعه ژني و وکتور خطي به کمک آنزيم DNA ligase T4 به هم متصل شوند.
محصول اتصال به داخل سلولهاي باکتري مستعد منتقل شد. سپس باکتريهاي فوق بر روي پليت LB حاوي کانامايسين کشت داده شدند. تعدادي از کلونها انتخاب شده و استخراج پلاسميد طبق روش قبلي انجام شد. به منظور تأييد وجود ژن pac در وکتور نوترکيب يکي از پلاسميدهاي نوترکيب انتخاب گرديد. پلاسميد نوترکيب حاصل نامگذاري شد (شکل ١). سپس از روش برش آنزيمي با استفاده از دو آنزيم NdeI و SalI (شرکت Fermentase) براي تأييد مورد استفاده قرار گرفت . جهت تأييد نهايي کلونينگ ژن pac پلاسميد نوترکيب براي تعيين توالي ارسال و اين تعيين توالي از دو جهت براي ژن pac بوسيله پرايمرهاي promoter T٧ و Avi-R انجام شد. سپس توالي نوکلئوتيدي ژن مذکور با توالي نوکلئوتيدي موجود درGenBank بوسيله برنامه BLAST مقايسه گرديد.
غربالگري بيولوژيکي کلونهاي مثبت توليد کننده پني سيلين G آسيلاز بوسيله Overlay test : پس از تأييد حضور ژن پني سيلين آسيلاز در وکتور بياني پلاسميد نوترکيب pac-pET26 به سلولهاي (BL21)E. coli منتقل شد. با اين آزمايش از طريق باکتري کلونهاي مثبت توليد کننده پني سيلين آسيلاز شناسايي گرديد. .S marcescens مقاوم به پني سيلين G و حساس به ٦- آمينوپني سيلانيک اسيد (APA-6) مي باشد. چنانچه کلون(هاي) مورد نظر بتواند آنزيم پني سيلين آسيلاز را توليد کند، پني سيلين G به APA-6 تبديل شده و در اطراف کلون هاي مثبت هاله عدم رشد تشکيل مي شود .(6)
روش انجام Overlay test
در اين آزمايش از طريق باکتري S. marcescen کلون هاي مثبت توليد کننده پني سيلين آسيلاز جداسازي گرديد. marcescens.S مقاوم به پني سيلين G و حساس به APA-٦ مي باشد. ابتدا کلون هاي نوترکيب بر روي محيط جامد حاوي g.l NaCl٥، g.l Beef extract٥، g.l Yeast extract ١٠ و g.l Agar ١٥ کشت داده شده و پليت ها در دماي ٢٨ درجه سانتي گراد حداقل به مدت ١٢ ساعت انکوبه گرديد. S. marcescens در محيط حاوي ١٠ گرم در ليتر پپتون و ٥ گرم در ليتر نمک طعام به مدت يک شبانه روز در دماي ٢٦ درجه سانتي گراد کشت داده شد. سپس ٥٠٠ ميکروليتر سلولهاي سراشيا با μl ٢٥٠ پني سيلين mg.ml( G ١٠٠) و٥ ميلي ليترmelt nutrient soft agar شامل ٣ گرم در ليتر عصاره گوساله ، ٥ گرم در ليتر پپتون و ٧.٥ گرم در ليتر آگار سريع مخلوط شده و بر روي پليت فوق پخش گرديد. پليت ها بهمراه کنترل منفي در دماي ٢٨ درجه سانتي گراد انکوبه گرديد. هاله عدم رشد به معناي توانايي سلولها در تبديل پني سلين به APA-٦ مي باشد (١١).
بررسي بيان آنزيم نوترکيب پني سيلين G آسيلاز در سلولهاي : القاء بيان پروتئين نوترکيب : جهت بيان پروتئين نوترکيب از روش شيميايي براي القا استفاده شد. ابتدا يک کلني از کشت تازه سلولهاي (BL٢١) coli.E حاوي وکتور در محيط کشت LB مايع حاوي mg.ml ٥٠ آنتي بيوتيک کانامايسين کشت داده شده و پس از ١٦ ساعت کشت (دما ٣٧ درجه سانتي گراد و rpm٢٠٠)، رقت ٥ درصد در محيط Mminimal9 بعلاوه ٢ ميلي مولار و ١٠٠ ميکرومولار حاوي ١٠ درصد گلوکز تهيه و در انکوباتور٣٧ درجه سانتي گراد با rpm ٢٠٠ قرار داده شد تا جذب نوري آن در طول موج ٦٠٠ نانومتر به ٠.٨ برسد. سپس بيان پروتيين با اضافه نمودن IPTG با غلظت نهايي ١ ميلي مولار به مدت ١٦ ساعت در دماي ٢٨ درجه سانتي گراد القاء شد. جهت بررسي بيان پروتئين نوترکيب در زمانهاي مختلف قبل و بعد القاء از محيط کشت نمونه برداري شد. نمونه ها (رسوب و روشناور) تا آماده سازي در دماي ٤ درجه سانتي گراد نگهداري شدند (٧ و ١٧).
استخراج محتواي پروتئيني تام سلولها: سلولهاي باکتريايي به دست آمده از يک ميلي ليتر از کشت سلولي ، پس از سانتريفوژ در به مدت ٥ دقيقه ، در حجم مناسبي از شامل Bromophenol Blue 0.2 درصد ، Mercaptoethanol-2 10 درصد، Glycerol ٢٠ درصد، SDS ٤ درصد با ٦.٨ pH حل شده و به مدت يک دقيقه جوشانده شد.
تفکيک پروتئينهاي پري پلاسمي ، سيتوپلاسمي و اينکلوژن بادي: باکتري حامل وکتور نوترکيب در ٥٠ ميلي ليتر محيط کشت LB مايع کشت داده شد. سلولهاي باکتريايي با سانتريفوژ در دور rmp ٥٠٠٠ به مدت ٥ دقيقه در دماي اتاق رسوب شده و اين رسوب در بافر TES سرد (mM EDTA ٠.٥، M Sucrose ٠.٥و 0.2M Tris-HCl با ٥.٨ pH) به ميزان ١٥ ميکروليتر به ازاي هر1.5 ميلي ليتر محيط کشت باکتري سوسپانسون شد. سوسپانسون باکتري به مدت ٣٠-١٥ دقيقه روي يخ تکان داده شده و به ازاي1.5 ميلي ليتر محيط کشت باکتري ٢٢.٥ ميکروليتر آب دو بار تقطير سرد به مخلوط فوق اضافه گرديد. محلول ٣٠ دقيقه ديگر روي يخ تکان داده شد. سپس سانتريفوژ در دور به مدت ٣٠ دقيقه در دماي ٤ درجه سانتي گراد انجام گرفت . محلول رويي محتوي پروتئين پري پلاسمي نتيجه شوک اسمزي بوده و رسوب حاوي پروتئينهاي سيتوپلاسمي است . به ازاي هر ميلي ليتر مايع رويي ١٢٠ ميکروليتر TCA صد در صد اضافه و به آرامي تکان داده تا به خوبي مخلوط گرديد، سپس به مدت ١٥ دقيقه روي يخ گذاشته ، سانتريفوژ در دور rmp ١٣٠٠٠ به مدت ١٠ دقيقه در دماي ٤ درجه سانتي گراد انجام و پروتئينهاي پري پلاسمي رسوب داده شد. بعد از خارج کردن روشناور، به رسوب حجم مناسبي از 2x Sample Solvent اضافه و به مدت ١ دقيقه جوشانده شد.
