بخشی از مقاله
بررسی پلی مورفیسم جایگاه Rsa1 (rs2031920) پروموتر ژن CYP 2E1 در افراد مبتلا به سرطان معده در استان مازندران
چکیده:
پلی مورفیسم ژنتیکی آنزیم های متابولیزه کننده کارسینوژن ها در استعداد ابتلا به سرطان تاثیر می گذارد. هدف از این مطالعه تعیین رابطه ی بین پلی مورفیسم ژنتیکیCYP 2E1 و خطر ابتلا به سرطان معده در استان مازندران است. پس از استخراج DNA از خون افراد بیمار و سالم به روش فنل کلروفرم، ژنوتیپ افراد به روش PCR-RFLP تعیین گردید. فراونی ژنوتیپ های CC، CT و TT در گروه بیمار به ترتیب %95، %5، % 0 و در گروه سالم %98، %2 و %0 مشاهده شد. این
مطالعه نشان داد هیچ رابطه معنی داری بین پلی مورفیسم Rsa1 ژن و خطر ابتلا به سرطان معده در استان
مازندران وجود ندارد.
کلمات کلیدی:پلی مورفیسم ، CYP 2E1،سرطان معده،مازندران
.1مقدمه:
سرطان معده چهارمین سرطان شایع و دومین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان در جهان محسوب می شود. [18,17] آمار و ارقام در ایران نشان دهنده ی بالا بودن نرخ بروز سرطان های دستگاه گوارش در استان های شمالی کشور بخصوص مازندران و گلستان است.[32] به دلیل پیش آگهی نامناسب ، این سرطان معمولا در مراحل پیشرفته تشخیص داده شده و در این مرحله به درمان های موجود پاسخ مناسب نشان نمی دهد، لذا باید اقداماتی در جهت پیشگیری این سرطان انجام شود.[19] سرطان معده جزء بیماری های چند عاملی طبقه بندی شده [29] و از عوامل ایحاد کننده آن می توان به ، فاکتور های محیطی مانند کشیدن سیگار و مصرف الکل، فاکتورهای ژنتیکی و نژادی، عفونت هلیکوباکتر پیلوری و سن بالا اشاره کرد.[28] اکثر سموم، گزنوبیوتیک ها و مواد شیمیایی سرطانزا جهت ایجاد فرم سرطانزایی، به تغییرات زیستی در بدن نیاز دارند.[16,26] طیف وسیعی از آنزیم های متابولیزه کننده ترکیبات در بدن انسان، دارای پلی مورفیسم ژنتیکی بوده و این تنوع ژنتیکی روی فعالیت و القاپذیری این آنزیم ها و همچنین استعداد ابتلا به سرطان تاثیر می گذارد.[6, 20, 25] آنزیم های سیتوکروم P450 مونواکسیژناز، خانواده ی بزرگی از هموپروتئین ها و از آنزیم های فاز یک سم زدایی می باشند که در تغییرات زیستی کارسینوژن ها نیز نقش دارندCYP 2E1 .[24] یکی از اعضای خانواده آنزیم های سیتوکروم P450 می باشد که نقش مهمی را در فعالسازی متابولیکی بسیاری از پری کارسینوژن ها ی محیطی از جمله کارسینوژن ها با وزن مولکولی اندک و همچنین ترکیبات Nنیتروز آمین ایفا می کند.[21,22] بنابراین پلی مورفیسم های ژنتیکی که فعالت آنرا تغییر می دهند، ممکن است در استعداد ابتلا به سرطان تاثیر بگذارند.[9] ژن این سیتوکروم روی کروموزوم 10 q26 -3 قرار داشته، 11/7 کیلو باز طول دارد و شامل نه اگزون و هشت اینترون می باشد. یکی از پلی مورفیسم های ژنتیکی موجود در ناحیه پروموتری این ژن، پلی مورفیسم Rsa1(rs2031920) ، با جابجایی نوکلئوتید C به T در موقعیت -1053، فعالیت این آنزیم را تغییر میدهد.[7] هدف از انجام این مطالعه، تعیین رابطه بین پلی مورفیسم Rsa1 ژنCYP 2E1 و خطر ابتلا به سرطان معده در استان مازندران است.
.2 مواد و روش ها:
جمع آوری نمونه:
در این مطالعه 40 بیمار مبتلا به سرطان معده که در فاصله سال های 1391 تا 1393 به بیمارستان های استان مازندران (از جمله بیمارستان های بابل کلینیک، مهرگان، روحانی و بهشتی و ... ) مراجعه کرده بودند به همراه 50 فرد سالم به عنوان کنترل مورد بررسی قرار گرفتند. از هر فرد 5 میلی لیتر از خون محیطی گرفته شد و خصوصیات دموگرافیک آنها از پرونده شان استخراج گردید (جدول . (1
استخراج DNA و انجام واکنش :PCR
استخراج DNA از خون و به روش فنل کلروفرم صورت گرفت. از تکنیک PCR-RFLP (polymerase chain reaction-
restriction fragment length polymorphism) جهت تعیین پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی Rsa1 (C-1053T) استفاده شد.
تکثیر قطعه 413 جفت بازی واجد ناحیه مورد نظر، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی سنتز شده توسط شرکت Generay biotech چین و در دستگاه ترموسایکلر شرکت Bio-Rad آمریکا صورت گرفت. واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر شامل 120 نانو گرم DNA ژنومی، 2/5 میکرولیتر بافر 10x PCR، 0/7 میکرو لیتر 50 ) MgCl2 میلی مولار )، 0/5 میکرو لیتر 10)dNTP میکرومولار)، 0/7 میکرولیتر از هر یک از پرایمرها 10) پیکو مول ) و 0/3 میکرولیتر Taq DNA polymerase (10U/ l) انجام شد. شرایط زمانی و دمایی PCR شامل واسرشت سازی اولیه به مدت زمان 4 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی گراد، 35 چرخه شامل واسرشت سازی به مدت 30 ثانیه در دمای 94 درجه سانتی گراد، اتصال آغازگرها 30 ثانیه در دمای اتصال 55 درجه سانتی گراد، طویلسازی به مدت 30 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی گراد و یک چرخه طویلسازی نهایی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه انجام پذیرفت. قطعات تکثیر شده در ژل آگارز 1/5 درصد، الکتروفورز ورنگ آمیزی توسط اتیدیوم صورت گرفت.
آنالیز :RFLP
به منظور تعیین پلی مورفیسم این جایگاه، محصول تکثیر ، مورد هضم آنزیمی توسط آنزیم برشی Rsa1 قرار گرفت. واکنش هضم آنزیمی در حجم 31 میکرولیتر شامل 0/5میکروگرم محصول PCR، 2 میکرولیتر از بافر آنزیم tango(10X) ، 1 میکرولیتر آنزیم 10U / O Rsa1(fermentase) و 18 میکرولیتر آب دوبار تقطیر انجام و مخلوط واکنش در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 8 ساعت نگهداری شد. قطعات حاصل از برش به همراه قطعه بدون هضم آنزیمی در ژل آگارز 2/5 درصد الکروفورز گردید. در ژنوتیپ وحشی در جایگاه (Rsa1)-1053 نوکلئوتید C وجود داشته و در نتیجه، توالی مورد شناسایی آنزیم برشی فراهم و بر اثر برش آنزیمی دو قطعه 360و63 جفت بازی ایجاد می شود ولی در صورت جهش تک نوکلئوتیدی در این جایگاه و تغییر نوکلئوتید C به T هضم آنزیمی رخ نداده وقطعه 413 جفت بازی بریده نمی شود. آلل C، آلل وحشی و آلل T آلل جهش یافته و بدین ترتیب ژنوتیپ هموزیگوت وحشی CC، هتروزیگوت CT و هموزیگوت موتانت TT نمایش داده می شوند.
آنالیز داده ها:
داده های بدست آمده با استفاده از نرم افزار spss (version16) و مدل رگرسیون لجستیک در سطح P< 0/05 مورد تجزیه آماری قرار گرفتند. همچنین جهت بررسی ارتباط بین ژنوتیپ ها و سرطان معده OR(Odd Ratio) و CI(Confidence Interval) مورد محاسبه قرار گرفتند.P<0/05 به عنوان مشخصه ارتباط مثبت بین ژنوتیپ ها با سرطان معده در نظر گرفته شد.
.3نتایج:
خصوصیات دموگرافیک و کلینوپاتولوژیکی:
در این مطالعه 40 بیمار متشکل(30( %75 نفر مرد و 10( %25) نفر زن با میانگین سنی بیماران 55 سال و50 فرد سالم،(37( %74 نفر مرد و 13( %26) نفر زن و با میانگین سنی 50 سال مورد بررسی قرار گرفتند. از بین بیماران مورد مطالعه تنها %15 افراد در مرحله I و II و%85 آنان در مرحله بیماری III وIV بودند. نتایج بصورت مختصر در جدول شماره 1 آورده شده است.
آنالیز آماری اختلاف معنی داری از نظر سن و جنس بین دو گروه بیمار و سالم نشان نداد که این نشاندهنده همسان سازی در این مطالعه می باشد.
آنالیز : PCR-RFLP
DNA ژنومی از نمونه های خون افراد سالم و بیمار استخراج و کیفیت DNA استخراج شده در ژل آگارز بررسی گردید. همچنین کمیت DNA به روش اسپکتروفوتومتری تعیین گردید (شکل.(1
شکل (1الکتروفورز DNAژنومی استخراج شده از خون افراد سالم و بیمار در ژل آگارز 0/8 درصد.
چاهک DNA 1-3 استخراج شده از خون افراد بیمار و چاهک DNA 4-8 استخراج شده از خون افراد سالم ار نشان می دهد. در شرایط بهینه PCR وبا استفاده از آغازگرهای اختصاصی، قطعه ای به طول حدود 400 جفت باز در ژل آگارز 1/5 درصد ظاهر گردید (شکل.(2
شکل:2الکتروفورز قطعه تکثیر شده مربوط به ناحیه پروموتری ژن CYP 2E1 در ژل آگارز 1/5 درصد. چاهک 1-4 مربوط به نمونه های کنترل( .(N 17-20چاهک :5نشانگر 100 جفت بازی شرکت فرمنتاز.
ژنوتیپ افراد بیمار مبتلا به سرطان معده و همچنین افراد سالم پس از هضم آنزیمی بر روی ژل آگارز 2/5 درصد مورد شناسایی قرار گرفت(شکل .(3
شکل:3 الکتروفورز قطعات حاصل از هضم آنزیمی قطعه 413 جفت بازی پروموتر ژن CYP 2E1 در ژل آگارز 2/5 درصد.چاهک:1نشانگر 100 جفت بازی،چاهک:2-3ژنوتیپ هموزیگوت وحشی (CC) واجد قطعات 360 و60 جفت بازی،چاهک :4ژنوتیپ هتروزیگوت (CT) واجد قطعات 360 و 413 جفت بازی،چاهک :5قطعه 413 جفت بازی بدون هضم آنزیمی.
قطعات تکثیر شده، در واکنش هضم توسط آنزیم Rsa1 قرار گرفته و محصول هضم در ژل آگارز الکتروفورز گردید. نتایج نشان داد که در بین 40 بیمار مبتلا به سرطان معده مورد مطالعه، 38( %95) فرد دارای ژنوتیپ CC ، 2( %5) فرد دارای ژنوتیپ CT و 0( %0) فرد دارای ژنوتیپ TT بودند. این میزان برای گروه سالم به ترتیب برای ژنوتیپ های CC،CTوTT ، 49( %98) ،(1( %2 و(0( %0 بوده است. فراوانی ژنوتیپی و آللی CC در گروه سالم بیشتر از گروه بیمار بود اما از نظر این ژنوتیپ اختلاف آماری معنی داری بین دو گروه وجود نداشت( p=0/4 )توزیع فراوانی ژنوتیپی و آللی در دو گروه بیمار و سالم در جدول 3 خلاصه شده است.
همانطور که در جدول شماره 4 نشان داده شده است، در جمعیت مورد مطالعه از نظر پلی مورفیسم Rsa1 ژن CYP 2E1، دو پنوع ژنوتیپ مشاهده شد. ژنوتیپ هتروزیگوت (CT) دارای 0/22-29/5 ) OR=2/5 CI 95%0 و (P 0/44 و ژنوتیپ هموزیگوت موتانت دارایCI 95%0 0/02-64/2 ) OR=1/2 و 0/9 (P بود. این نتایج نشان می دهد که هیچ رابطه آماری معنی داری بین پلی مورفیسم Rsa1 ژنCYP 2E1 و خطر ابتلا به سرطان معده در استان مازندران وجود ندارد.
