بخشی از مقاله
چکیده
باکتري هاي نمک دوست گروهی از میکروارگانیسم ها هستند که به زندگی در محیط هایی با شوري بالا سازش یافته اند. با توجه به اهمیت و کاربردهاي زیادي که این گروه از باکتري ها در زمینه هاي بیوتکنولوژي وصنعتی دارند و اینکه انتظار می رفت دریاچه اورمیه زیستگاه باکتري هاي نمک دوست منحصر به فرد باشد، در صدد بررسی این گروه از باکتري ها در دریاچه ارومیه برآمدیم. جهت نیل به این هدف نمونه هاي آبی روي شش محیط مختلف کشت داده شد. از کشت نمونه هاي آبی، سی و هفت ایزوله بدست آمد. تکثیر و توالی یابی ژن 16S rRNA وآزمایشات مختلف فنوتیپی روي ایزوله هاصورت گرفت.
رشد سویه ها در دماي 25-35◦C، 6-10pH و - w/v - NaCl %7-20 صورت گرفت که نشان می دهد بیشتر ایزوله ها نمک دوست نسبی اند. تست کاتالاز، اکسیداز و اوره آز براي بیشتر ایزوله ها مثبت بود. مطالعات فیلوژنتیکی حاصله از آنالیز ژن 16S rRNA وآزمایشات بیوشیمیایی، باکتري هاي ایزوله شده را در دو گروه اصلی %92 - Gammaproteobacteria، شاملPseudomonas [14%], [46%], Salicola Marinobacter [12%], Idiomarina [12%], و - Halomonas [8%] و%8 - Firmicutes، شامل Bacillus [5%] و - Halobacillus[3%] قرار داد. شباهت سطوح ژن 16S rRNA به همراه خصوصیات فنوتیپی، پیشنهاد کرد که برخی از سویه هاي جداشده به عنوان گونه جدید مطرح هستند. براي حصول اطمینان تست هاي تکمیلی دیگر توصیه می شود.
مقدمه
مطالعه زندگی میکروارگانیسم ها در محیط هاي شور به لحاظ بررسی تنوع زیستی این موجودات وتوانایی هاي ویژه اي که در تحمل شرایط دشوار، تولید انواع آنزیم ها و متابولیت ها، تجزیه ماکرومولکول هاي مختلف و پالایش زیستی دارند، از دیرباز مورد توجه محققین قرار داشته است . - 2,5,6,8 - باکتري هاي نمک دوست داراي خصوصیات فیزیولوژیکی مفیدي هستند که بهره برداري از آنها را در زمینه هاي تجاري تسهیل می کند.
اولا بیشتر آنها می توانند در غلظت هاي بالاي نمکی رشد کنند به این ترتیب ریسک آلودگی آنها به حداقل می رسد. دوما به آسانی رشد نموده و نیازهاي تغذیه اي آنها ساده است . بعلاوه، بیشتر ابزارهاي ژنتیکی براي باکتریهاي غیرنمک دوست میتواند براي باکتریهاي نمک دوست نیزمورد استفاده قرارگیرد. از اینرو دستورزي ژنتیکی آنها نسبتاً ساده است - . - 10 با توجه به اهمیت اقتصادي و کاربردي این باکتري ها در زمینه هاي مختلف بیوتکنولوژي و صنعتی و از آن جا که تا به حال مطالعه دقیق و همه جانبه اي بر روي تنوع زیستی باکتري هاي نمک دوست دریاچه اورمیه صورت نگرفته بود، بر آن شدیم تا تحقیقی در مورد فلورباکتریایی دریاچه داشته باشیم تا بدین وسیله در شناسایی ذخیره ژنتیکی این منطقه منحصر به فرد، گام کوچکی برداشته باشیم. در این راستا آزمایش هاي مختلف بیوشیمیایی و تکثیر و توالی یابی ژن 16S rRNA صورت گرفت.
مواد و روش ها جدا سازي باکتري ها: نمونه گیري در حواشی اسکله دریاچه ارومیه، در فصول مختلف سال هاي 85 و 88 صورت گرفت. 400میکرولیتر از هر نمونه آب روي محیطهاي جامدMH medium، Halomonas medium، Marine agar - Difco - ، MGM با 2، 7، 15و NaCl%25، Nutrient agar با 10% NaClو - Luria-Bertani - LB با 7.5% NaCl تلقیح و در دماي30◦Cبه مدت 7 روز انکوبه شدند. آزمایشات فنوتیپی: آزمایشات فنوتیپی شامل رنگ آمیزي گرم، کاتالاز، اکسیداز، تولید اندول و هیدروژن سولفوره، احیاي نیترات، اوره آز، هیدرولیز نشاسته، تیروزین، کازئین، ژلاتین، Tween 20 وTween80 بر اساس روش ماتا و همکاران - 2002 - و کوان و همکاران - 2003 - انجام گرفت 7 - ،. - 1 تولید اسید از هفده قند صورت گرفت. رشد در غلظت هاي مختلف نمک %0-30 - با افزایش 2/5 برابري - ، دماهاي مختلف 4-45 درجه سانتی گراد - با افزایش 5 برابري - و نیز 5-10pHانجام گرفت.
شناسایی مولکولی و فیلوژنی سویه هاي نمک دوست
تکثیر ژن:16S rRNA با PCR و با استفاده از آغازگرهاي عمومی 27F - 5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3΄ - و 1492R - 5′ -GGTTACCTT GTTACGACTT- 3΄ - ، ژن 16S rRNA تکثیر شد. محصول PCR بعد الکتروفورز و مشاهده باند 1500bp، مستقیما توسط شرکت ماکروژن کره توسط سه پرایمر طراحی شده H550 - 5'-CCAGTAATTCCGATTAACGC- 3' - H400 - 5'-GGG TTG TAAAGC ACT TTC AG-3' - و - 'H900 - 5'-ACT CAA ATG AAT TGA CGG GG-3 توالی یابی شد.
بررسی نتایج توالی یابی با استفاده از نرم افزارهايبیوانفورماتیکی و بانکهاي اطلاعات جهانی: نتایج توالی یابی پس از بررسی و مطابقت آنها با کروماتوگراف هاي مربوطه از لحاظ صحت نوکلئوتیدهاي توالی یابی شده، به کمک نرم افزارهاي بیوانفورماتیکیEditseq، Blast ، Chromas و توالی هاي موجود در بانک هاي اطلاعاتیExpasy، www. Eztaxon.org وNCBI مورد marasensis7Sm5Tو Salicola salis بررسی قرار گرفتند. درخت فیلوژنی سویه هاي یافت شده بعد مولت الین چندگانه با Clustal W، توسط نرم افزارMega 41 با روش Neighbor joiningرسم و قرابت ژنتیکی سویه هاي بومی با سویه هاي باکتریایی شناسایی شده، مشخص شد.
نتایج و بحث
سی و هفت تک کلنی از کشت نمونه هاي آبی روي محیط کشت هاي مختلف بدست آمد بطوریکه بیشتر آنها گرم منفی بودند. رنگ کلنی ها سفید، کرمی، نارنجی و قرمز بود. تمامی ایزوله ها کاتالاز مثبت بودند. بیشتر ایزوله ها آمیلاز و کازئیناز منفی بودند در حالیکه داراي فعالیت اوره از و اکسیداز بودند. برخی از سویه ها نیترات را به نیتریت احیا نمودند، برخی دیگر این پروسه را تا تولید NO،N2OیاN2 ادامه دادند. آنالیز داده هاي بدست آمده از ژن 16S rRNA و درخت فیلوژنتیک - شکل - 1 نشان داد که سویه هاي ایزوله شده به دو گروه اصلیGammaproteobacteria وFirmicutes تعلق داشتند.
گروه اول Gammaproteobacteria - %92 - ، متشکل از پنج جنس Idiomarina ,Halomonas, Salicola, Pseudomonas وMarinobacter بود. %46 ایزوله ها متعلق به جنس Salicola بود. باکتري هاي این گروه % 99 شباهت با نزدیکترین باکتري ها از نظر فیلوژنی، Salicola را نشان داد - شکل . - 1 این باکتري ها تنوع نوکلئوتیدي در موقعیت هاي 86 و 861 - مطابق با شماره گذاري - E. coli مابین خود نشان دادند. ایزوله هاي متعلق به جنس Marinobacter داراي %97 شباهت با ATCC Marinobacter hydrocarbonoclasticus 49840T بودند. سویه هاي ایزوله شده متعلق به جنس Idiomarina داراي%97-100 شباهت مابین خود بودند. گروه دوم،Firmicutes متشکل از دو جنس Halobacillus وBacillus، 8 %سویه هاي جدا شده را تشکیل داد. برخی ازتوالی هاي ژن 16S rRNA بدست آمده در این تحقیق در بانک اطلاعات جهانی با اکسشن نامبر هاي-EU305725 EU305729, EU251075 وHQ190037- HQ190041 ثبت گردید.
