بخشی از مقاله
چکیده
هیدروکربنهای آروماتیک آلودهکنندههای متداول ناشی از رهاسازی فراوردههای نفتی میباشند. در میان این ترکیبات، بنزن به خاطر سمیت و قابلیت سرطانزایی آن مورد توجه زیادی قرار گرفته است. از آنجاییکه میکروارگانیسمها توانایی استفاده از هیدروکربنهای آروماتیک به عنوان منبع کربن و انرژی را دارا میباشند، میتوانند برای کاربردهای پاکسازی زیستی مورد استفاده قرار گیرند. هدف از این پژوهش جداسازی و تعیین خصوصیات باکتریهای تجزیهکننده بنزن از خاک و پساب مجتمع ککسازی و پالایش قطران زرند و بررسی توانایی آنها در حذف بنزن بود. برای جداسازی باکتریهای تجزیه کننده بنزن، نمونههای خاک و پساب به محیط نمکی حداقل دارای بنزن اضافه شدند. در ابتدا 12 جدایه باکتریایی از نمونهها جداسازی گردید. چهار جدایه بر اساس سطح بالای مقاومت به بنزن غربالگری شدند.
این جدایهها بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی، تستهای بیوشیمیایی و آنالیز توالی ژن 16s rRNA شناسایی شدند. این جدایهها بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی، تستهای بیوشیمیایی و آنالیز توالی ژن s 16rRNA شناسایی شدند. آنالیز توالی ژن 16s rRNA نشان داد که این جدایهها مربوط به Pseudomonas putida BSH-1, Pseudomonas Bacillus sp stutzeri BSH-3, Pseudomonas xanthomarina BSH-2 میباشند. میزان رشد جدایهها بوسیلهی اندازهگیری کدورت بهعنوان چگالی نوری در 600 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر UV بررسی شد. نتایج این بررسی نشان داد که این سویههای جداسازیشده میتوانند جهت پاکسازی زیستی بنزن مورد توجه قرار گیرند.
کلمات کلیدی: بنزن، باکتریهای تجزیهکننده، ککسازی، زرند
مقدمه
مطالعات بروی حیوانات و انسان نشان می دهد که هیدرو کربن هایی از قبیل بنزن به طور موثری از طریق استنشاق جذب می گردند و باعث آسیب به قلب می شوند.[12]همچنین تحقیقات نشان داده اند که بنزن ترکیبی سرطانزا است. از بنزن در گذشته به عنوان حلال متداول در آزمایشگاه ها استفاده می شده است ولی بعد از اینکه دانشمندان پی به هویت سرطانزای آن بردند، استفاده از آن به عنوان یک حلال بسیار محدود گردید و سعی شد از حلال هایی مشابه استون استفاده شود. تماس طولانی مدت با بنزن، تاثیرات مخربی را بر روی بافت های سازنده سلول های خون خصوصا سلول های مغز استخوان می گذارد.
عوارض تماس با بنزن، کاهش خون سازی بدن، ناتوانی در سیستم ایمنی بدن و همچنین لوسمی، اختلال در سیستمتنفسی، تأخیر در استخوان بندی جنین انسان، صدمه به سیستم تولید مثل انسان، ناباروری، تولید تومورهای غدد لنفاوی و صدمه به کبد است. چندین موسسه از جمله انجمن تحقیقات سرطان دنیا، انجمن حفاظت محیط زیست آمریکا و اداره خدمات بهداشت آمریکا، بنزن را عامل سرطان خون و جزء گروه یک سرطانزاها معرفی کردند.[5] اگرچه ترکیبات آلی در برابر تبخیر بسیار مقاومند و به علت داشتن مشتقات آروماتیکی در ساختمانشان می توانند برای مدت زمان طولانی در محیط باقی بمانند، اما جمعیتهای میکروبی موجود در جایگاه آلوده شده، سرعت تجزیهی این ترکیبات پایدار را افزایش میدهند.[14]
تا کنون روشهای فیزیکوشیمیایی و بیولوژیک گوناگونی برای پاکسازی جایگاههای آلوده مورد استفاده فرار گرفته است. یک از این روشها اصلاح زیستی است.1 اصلاح زیستی عبارت است از بکارگیری میکرواورگانیسمها برایحذف آلودگیهای محیطی. این روش برای پاکسازی مواد سمی زیان آور و همچنین پاکسازی آلودگیهای نفتی به کار میرود.باکتریها با استفاده از واکنش های تنفسی هوازی و بیهوازی، تخمیر، کومتابولیسم2 و دهالوژنه کردن، ترکیبات آلی آلوده کننده را به ترکیبات کم ضررتر تبدیل کرده و از آن ها به عنوان تنها منبع کربن و انرژی استفاده می کنند. تحقیقات نشان داده است که میکروارگانیسم های بومی مناطق آلوده به ترکیبات نفتی در تجزیهی زیستی آلاینده های نفتی محیط زیست بسیار مؤثرتر ازسایر ارگانیسم ها می باشند. همچنین سرعت تجزیه زیستی در مناطق آلوده به عواملی مانند جمعیت میکروبی موجود در منطقهی آلوده، میزان و نوع آلودگی، نوع ترکیبات آلاینده، شرایط شیمیایی و زمین شناسی منطقه آلوده بستگی دارد.[10]
مواد و روشها
مواد لازم در این تحقیق شامل: بنزن, محیط کشت های نوترینت براث, نوترینت آگار, مواد تشکیل دهنده محیط MSM3از شرکت مرک آلمان و کیت PCR 4 از شرکت فرمنتاز خریداری گردید. از آنجایی که هدف از این تحقیق جداسازی باکتریهای تجزیه کننده بنزن از کارخانه کک سازی و پالایش قطران زرند میباشد، نمونه های خاک از عمق 0 تا 10 سانتی متری از سطح زمین از 9 ایستگاه مختلف کارخانه گرفته شد، ایستگاه های مورد نظر بر اساس میزان آلودگی انتخاب گردیدند. نمونهها درظروف مخصوص نمونه گیری و شرایط استریل روی یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. غنیسازی درون 9 ارلن هر کدام نود و نه میلیلیتر از محیط کشت MSM انتقال داده شده، و در 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردید.
سپس به هر ارلن یک میلیلیتر بنزن استریل اضافه شد. مقدار یک گرم از هر نمونه به ارلنها افزوده شده، شمارهگذاری گردید و در نهایت به مدت 7 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد با دور 180 rpm انکوبه شد.[8 , 11] بنزن مورد استفاده در این تحقیق باید فاقد هرگونه آلودگی باشد. با توجه به سمیت شدید بنزن این مراحل در زیر هود و با دستکش و ماسک صورت میگیرد. غنی سازی دو مرتبه صورت می گیرد، در مرتبه دوم از نمونه های بدست آمده از مرتبه اول غنی سازی برداشت می شود. در ادامه به منظور خالصسازی باکتریها به محیط MSM آگار اضافه شده،تا کلنی های باکتری شناسایی و تفکیک شوند.[8 , 11]
برای غربالگری باکتریهای دارای رشد بیشتر در غلظتهای مختلف بنزن .[8]از نمونههای آماده شده در مرحله قبلبرداشت شده و درون کوت شیشهای ریخته شد. جذب نوری آنها در 600 نانومتر سنجیده شد.برای حذف و شناسایی دقیقترباکتریهایی که توانایی کمتری برای رشد در مواجه با بنزن دارند، از روش CFU5 استفاده شد .[8]شناسایی اولیه سویههای غربالگری شده بر اساس تستهای اولیه شامل رنگآمیزی گرم، شکل میکروسکوپی، شکل و رنگ کلونی، حرکت، تست اکسیداز، کاتالاز صورت گرفت. در پایان برای شناسایی دقیق سویه های مورد نظر آنالیز توالی ژن 16s rRNA انجام گرفت.
نتایج و بحث
نتایج خالص سازی بعد از پاساژهای متعدد که روی محیط جامد صورت گرفت. 12 کلنی مختلف جداسازی شد، همه نمونه های گرفته شده از کارخانه دارای یک نوع کلنی ولی نمونه شماره 8 دارای سه کلنی تقریبا متفاوت و نمونه شماره 9 دارای دو نوع کلنی متفاوت بود.جداسازی باکتری های تجزیه کننده بنزن اثر غلظت های مختلف بر رشد باکتری اندازه گیری شد، بدین صورت که بعد از کشت باکتری ها در محیط پایه نمکی حاوی بنزن و 7 روز شیکر انکوباتور، جذب نوری نمونه ها در 600نانومتر اندازه گیری شد، که تعداد 6 نمونه که دارای جذب بالاتری بودند انتخاب شدند و بقیه نمونه ها حذف شدند.
نتایج غربالگری باکتری های تجزیه کننده بنزن بر اساس روش CFU
در این مرحله 6 نمونه را مورد آزمایش قرار دادیم که نتایج آن در جدول 1 و نمودار1 آورده شده است.
