بخشی از مقاله
جداسازي و شناسایی باکتری هاي بومی تجزیه کننده سلولز از خاك
چکیده
مطالعه حاضر جداسازي و شناسایی باکتریهاي ترموفیلیک 60) درجه سانتی گراد) و مزوفیلیک 37) درجه سانتی گراد) تجزیه کننده سلولز را از خاك نشان میدهد. باکتریهاي ترموفیل و مزوفیل با استفاده از روش رقتسازي متوالی پس از غنیسازي محیطهاي رشد در حضور میکروکریستالین سلولز به عنوان تنها منبع کربن، جداسازي و خالصسازي شدند. غربالگري باکتریهاي خالص سازي شده براي شناسایی باکتریهاي تولید کننده آنزیم سلولاز با استفاده از تکنیک زایموگرام در پلیت انجام شد. از میان سویههاي سلولیتیک، 12 سویه ترموفیل و 12 سویه مزوفیل براساس میزان فعالیت آنزیم، درصد رشد و میزان پروتئین خارج سلولی با یکدیگر مقایسه و سویههاي داراي بیشترین فعالیت آنزیم سلولاز از طریق توالییابی ژن 16S rRNA شناسایی شدند. نتایج نشان داد این سویهها به جنسهاي Bacillus، Geobacillus و Chryseobacterium تعلق دارند. سویه برتر ترموفیل و مزوفیل جهت شناسایی دما و pH بهینه مورد بررسی قرار گرفتند که سویه ترموفیل در دماي 50 درجه سانتی گراد و 6/5 pH و سویه مزوفیل در دماي 37 درجه سانتی گراد و 8/5 pH بهترین عملکرد را نشان دادند. بر اساس نتایج به دست آمده، این باکتریها از پتانسیل لازم جهت تبدیل ضایعات سلولیتیک شهري و کشاورزي به مواد داراي ارزش افزوده برخوردار میباشند.
واژههاي کلیدي: سلولز، سلولاز، باکتریهاي سلولیتیک، Bacillus، .Geobacillus
مقدمه
استفاده از ضایعات لیگنوسلولزي براي تولید سوختهاي زیستی به دلیل فراوانی، دسترسی آسان، قیمت پایین و تجدیدپذیري طی چند دهه گذشته افزایش یافته است.
سلولز از اجزاء اصلی زیستتودههاي لیگنوسلولزي است که به دلیل برخورداري از ظرفیت مناسب براي تولید سوخت سبز و پاك در سرتاسر جهان مورد توجه میباشد 4)، 7 و .(12 موانع متعددي براي تولید سوخت زیستی از ضایعات سلولزي وجود دارد از جمله این موانع میتوان به ساختار پایدار سلولز همراه با هزینه بالا و عملکرد پایین آنزیمهاي سلولازي اشاره کرد. ساختار پایدار سلولز میتواند به وسیله پیش تیمارهاي فیزیکی و شیمیایی برداشته شود، درحالی که عملکرد آنزیم را می توان از طریق ایجاد محیط هاي مناسب رشد براي میکروارگانیسمهاي طبیعی یا دستکاري شده افزایش داد 10)، 15 و .(21
مکانیزم هیدرولیز آنزیمی سلولز شامل همکاري سه آنزیم اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز، و بتاگلوکوزیداز میباشد. میکروارگانیسمهایی مثل باکتریها، قارچها و اکتینومایستها براي تجزیه ترکیبات سلولزي این آنزیمها را به صورت مجزا و نیز به صورت ساختار پیچیده متصل به هم تولید میکنند(22 و .(24 هزینه تولید سلولاز بیش از 40 درصد از کل هزینه تبدیل ضایعات سلولزي به بیواتانول را دربر میگیرد 3)، .(7
مطالعات جهت جداسازي و شناسایی میکروبهاي سلولیتیک قوي ادامه دارد و میکروبهاي سلولیتیک زیادي
مانند: Bifidobacterium breve، Thielavia terrestris، Clostridium Sp.، Bacillus Sp.، Cellulomonas Sp. و ... گزارش شده است. Bisaria and Ghose تعدادي از قارچها و باکتریهایی که توانایی تجزیه سلولز نامحلول در شرایط آزمایشگاهی را از طریق تولید سلولازهاي خارج سلولی دارند ارائه دادهاند. گونههاي قارچی عبارتند از : T. reesei، T. viride، T. coningi، Penicillium funiculosum، Pulverulentum، Fusarium solani و .Sclerotium rolfsii گونههاي باکتریایی عبارتند ازCellulomonas clostridium، Bacillus، Thermonorospora، Flavobactrium و .(6) Thermoactinomycetes
امروزه تولید و پرورش میکروارگانیسمهایی که با سرعت بیشتر و هزینه کمتر موجب تولید این آنزیمها میشوند مد نظر بسیاري از محققین میباشد. بیشک در آینده بسیار نزدیک شاهد تولید قند، اتانول و دیگر محصولات تخمیري از زبالههاي مواد غذایی، کاغذهاي باطله، پسماندهاي کشاورزي نظیر کاه و دیگر منابع سلولزي خواهیم بود .(8)
هدف از این مطالعه: -1 غنیسازي نمونه خاك انتخاب شده از پارك جنگلی چیتگر -2 جداسازي باکتریهاي تولید کننده آنزیم سلولاز از نمونه خاك غنیسازي شده -3 مقایسه باکتریهاي تولیدکننده آنزیم سلولاز و شناسایی ایزولههاي برتر می باشد.
مواد و روشها
غنیسازي و جداسازي باکتریهاي تجزیه کننده سلولز:
نمونه خاك از پارك جنگلی چیتگر در شهر تهران در ایران انتخاب شد. غنی سازي نمونه خاك با استفاده از محیط کشت با ترکیب (گرم در لیتر) : 1 میلیلیتر محلول 0/3 درصد کلرید آهن Ш، 0/05 گرم کلرید کلسیم، 0/01 گرم سولفات منیزیم، 0/01 گرم کلرید پتاسیم، 0/01 گرم کلرید کلسیم، 0/3 گرم کلرید آمونیوم، 0/05 گرم عصاره مخمر و 1 میلیلیتر از محلول Nitsch’s trace element با ترکیب (گرم در لیتر): 2/2 گرم سولفات منگنز، 0/5 گرم سولفات روي، 0/5 گرم اسید بوریک، 0/016 گرم سولفات مس، 0/025 گرم مولیبدات سدیم و 0/046 گرم کلرید کبالت انجام شد .(17) این محیط با 0/5 گرم در لیتر از میکروکریستالین سلولز به عنوان تنها منبع کربن تکمیل گردید. pH محیط قبل از اتوکلاو با استفاده از 10 NaOH مولار بر روي 7 تنظیم شد.
یک گرم از نمونه خاك در ارلن مایر 100 میلیلیتري حاوي 50 میلیلیتر محیط کشت استریل تلقیح شد. 12 ارلن به این صورت آماده و براي جداسازي باکتریهاي ترموفیل 6 ارلن در دماي 60 درجه سانتی گراد و براي جداسازي باکتریهاي مزوفیل 6 ارلن در دماي 37 درجه سانتی گراد بر روي شیکر با دور 120 rpm براي 6 روز انکوبه شدند.
از مخلوط هر ارلن 1 میلیلیتر به ارلن حاوي محیط تازه منتقل و در همان شرایط انکوباسیون انجام شد. این فرایند 5 بار تکرار شده و کشتهاي نهایی براي جداسازي و خالص سازي مخلوط باکتریهاي به دست آمده از غنی- سازي صورت گرفته با استفاده از کلرید سدیم 0/85 درصد به روش رقتسازي متوالی استفاده شدند. در این روش رقتهاي متوالی تهیه و از هر رقت 100 میکرولیتر بر روي پلیت آگار شامل محیط غنیسازي جامد شده به وسیله آگار بدون ماده مغذي 15) گرم در لیتر) اسپري کرده و پلیتها در دماهاي 60 و 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. پلیتها پس از 24 ساعت بررسی شده و کلنیهاي تک رشد کرده براي 3 مرتبه به صورت خطی کشت داده شدند تا از خلوص آنها اطمینان کامل حاصل گردد .(17)
شناسایی باکتريهاي سلولیتیک: محیط کشت زایموگرام با ترکیب (گرم در لیتر) : 2 گرم سدیم نیترات، 1 گرم دي-
پتاسیم هیدروژن فسفات، 0/5 گرم سولفات منیزیم، 0/5 گرم کلرید پتاسیم، 2 گرم کربوکسی متیل سلولز، 0/2 گرم پپتون مخصوص میکروبیولوژي و 17 گرم آگار تهیه شد.
سویههاي خالص شده به صورت نقطهاي بر روي این محیط کشت داده شدند، بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دماهاي37 و 60 درجه سانتیگراد پلیتها با استفاده از روشهاي Gram’s Iodine و کنگورد رنگ آمیزي شدند تا ایزولههاي سلولیتیک از طریق ایجاد هاله شفاف از دیگر ایزولهها شناسایی شوند .(9)
تعیین میزان فعالیت آنزیم و درصد رشد: جهت تعیین درصد رشد و میزان فعالیت آنزیم باکتریهاي مزوفیل در محیط تولید آنزیم شامل محیط کشت LB حاوي 0/5 گرم در لیتر کربوکسی متیل سلولز، و باکتریهاي ترموفیل در محیط غنیسازي کشت داده شدند. پس از 24 ساعت میزان فعالیت آنزیم به روش دينیتروسالیسیلیک اسید (DNS) بر اساس مقدار قندهاي احیاء کننده آزاد شده از کربوکسی متیل سلولز تعیین شد .(13) مخلوط آزمایش 1 میلیلیتر شامل 500 میکرولیتر از کربوکسی متیل سلولز 1 (CMC) درصد در بافر سیترات-فسفات 6/5 pH و 500 میکرولیتر سوپرناتانت کشت به عنوان آنزیم آماده شد، این مخلوط 1 ساعت در 50oC انکوبه و واکنش با اضافه کردن محلول 3) DNS میلیلیتر) متوقف گردید. نمونه ها 15 دقیقه در 100 درجه سانتی گراد انکوبه شده و براي تثبیت رنگ براي 5 دقیقه بر روي یخ قرار داده شدند. پس از آنکه نمونهها خنک شدند جذب نوري هرنمونه در طول موج 550 نانومتر در مقابل نمونه کنترل که کاملاً شبیه نمونه آزمایش بدون گرماگذاري در 50 درجه سانتی گراد تهیه شده بود اندازهگیري شد. فعالیت سلولاز با استفاده از منحنی استاندارد گلوگز تعیین گردید. یک واحد از فعالیت آنزیم معادل مقداري از آنزیم میباشد که یک میکرومول از گلوگز در دقیقه آزاد کند.
براي تعیین سرعت رشد 5 میلیلیتر از محیط برداشته و به وسیله سانتریفیوز 30) دقیقه در (12000 g سلولها از سوپرناتانت جدا شدند. سلولها در یک میلیلیتر -هیدروکسید سدیم یک نرمال به صورت محلول در آمده و براي 10 دقیقه در 100 درجه سانتی گراد انکوبه شدند.
سلولهاي تخریب شده به وسیله سانتریفیوز 30) دقیقه در (12000g رسوب داده شدند و مقدار پروتئین آزاد شده در اثر تخریب سلولها به روش لوري با استفاده از استاندارد Bovin serum albumin در سوپرناتانت اندازهگیري شد.
مقدار پروتئین سلولی میتواند شاخصی براي تعیین رشد باشد 11) و .(20
غلظت پروتئین محلول با استفاده از روش بردفورد (Bradford MM., 1976) اندازهگیري شد .(5) براي تهیه منحنی استاندارد از محلول Bovin serum albomin استفاده شد. جذب نوري نمونههاي آماده شده بعد از 20 دقیقه انکوباسیون در دماي اتاق در طول موج 595 نانومتر اندازه گیري شد.
شناسایی مولکولی ایزولههاي برتر: ایزولههایی که بیشترین تولید آنزیم سلولاز را در مقایسه با سایر ایزولهها نشان دادند انتخاب و بر اساس توالییابی بخشی از ژن 16S rRNA شناسایی شدند. استخراج DNA باکتري با تغییراتی در روش Sambrook و (2011) Russell انجام شد .(19) کل DNA به دست آمده جهت تکثیر بخشی از ژن 16S rRNA به همراه دو پرایمر عمومی 27 F و 1495 R استفاده شد .(14)
مخلوط واکنش زنجیرهاي پلیمراز در حجم 25 میکرولیتر شامل 1/5 mM MgCl2، از هر 0/4 dNTPs میلی مولار، از هر پرایمر 25 pmol، 100 DNA نانوگرم، پلیمراز 0/5 U و 2/5میکرولیتر از 10x PCR buffer تهیه شد. واکنش PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلر طبق مراحل زیر انجام شد : واسرشت سازي اولیه در دماي 94 درجه سانتی گراد براي 5 دقیقه، 35 سیکل شامل واسرشت سازي در دماي ٩٤ درجه سانتي گراد براي ١ دقيقه ، اتصال در دماي ٥٥ درجه سانتي گراد براي ١دقيقه ، توسعه در دماي ٧٢ درجه سانتي گراد براي ٢ دقيقه و يک مرحله توسعه نهايي براي ١٠ دقيقه (١٤).
محصولات به دست آمده از واکنش زنجيره اي پليمراز جهت توالي يابي ، از طريق شرکت سيناژن به شرکت Sourcebioscience فرستاده شده و به روش Sanger توالي يابي شدند. تواليهاي به دست آمده با استفاده از نرم افزار Blast در بانک ژن با ديگر تواليهاي موجود در اين پايگاه اطلاعاتي مقايسه شدند. درختچه هاي فيلوژني به روش neighbor-joining با استفاده از نرم افزار CLUSTAL در برنامه ٥ MEGA ترسيم شدند (١٨ و ٢٣).
بر اساس حداقل خطا از درخت توپولوژي Boot strap براي هر نمونه ١٠٠٠ تکرار بود.
اثر pH و دما بر فعاليت آنزيم CMCase : اثر pH محيط کشت بر فعاليت کربوکسي متيل سلولاز (CMCase) توليد شده توسط سويه برتر ترموفيل و مزوفيل از طريق ساخت محيط کشت با pHهاي متغيير بررسي شد. pH محيط از ٤ تا ٩.٥ با افزايش ٠.٥ واحدي با استفاده از NaOH و HCl ١٠ مولار تنظيم و سويه برتر ترموفيل و مزوفيل در اين محيطها کشت داده شدند. کشتهاي تهيه شده در دماي ٥٠ درجه سانتي گراد براي سويه ترموفيل و دماي ٣٧ درجه سانتي گراد براي سويه مزوفيل انکوبه شدند. پس از ٢٤ ساعت ، فعاليت کربوکسي متيل سلولاز (CMCase) حاصل از محيطهاي داراي pHهاي مختلف اندازه گيري و pH بهينه تعيين شد.
اثر دما بر توليد آنزيم از طريق انکوباسيون محيط هاي کشت با pH بهينه در دماهاي مختلف بررسي شد.
انکوباسيون سويه ترموفيل در دماهاي (٣٠، ٤٠، ٥٠، ٦٠ درجه سانتي گراد) و انکوباسيون سويه مزوفيل در دماهاي (٣٠، ٣٥، ٣٧، ٤٠، ٤٥، ٥٠، درجه سانتي گراد) صورت گرفت . پس از ٢٤ ساعت فعاليت کربوکسي متيل سلولاز (CMCase) حاصل از انکوباسيون در دماهاي مختلف اندازه گيري و دماي بهينه تعيين شد.
شکل ١- پليت زايموگرام جهت غربالگري و شناسايي باکتريهاي توليد کننده آنزيم سلولاز از طريق ايجاد هاله شفاف بر روي محيط حاوي CMC بعد از ٢٤ ساعت انکوباسيون و رنگ آميزي به وسيله (A) کنگورد و (B)Gram’s iodine
نتايج
جداسازي و شناسايي باکتريهاي تجزيه کننده سلولز:
تعدادي ايزوله باکتريايي از نمونه خاک جداسازي و خالص سازي شدند. ايزوله هاي انتخاب شده طي ٢٤ ساعت بر روي پليت رشد کرده و کلنيهاي صاف ، گرد و خامه اي ايجاد کردند. بعضي ايزوله ها قادر به توليد رنگدانه در محيط کشت بودند. در بررسيهاي ميکروسکوپي ، باکتريها ميله اي گرم مثبت و منفي ديده شدند. از ميان باکتريهاي خالص سازي شده ١٢ ايزوله ترموفيل و ١٢ ايزوله مزوفيل به خوبي بر روي محيط حداقل رشد کرده و توانايي ايجاد هاله شفاف بر روي پليت زايموگرام را نشان دادند (شکل ١). اين ايزوله ها براي ادامه مطالعه انتخاب شدند. جداسازي ايزوله هاي برتر : ١٢ ايزوله ترموفيل و ١٢ ايزوله مزوفيل بر اساس نتايج غربالگري انتخاب شدند. اين ايزوله ها بر اساس ميزان پروتئين محلول ، درصد رشد، و ميزان فعاليت CMCase با يکديگر مقايسه شده و ايزوله - هايي که بيشترين فعاليت آنزيم سلولاز را نشان دادند شناسايي و انتخاب شدند (نمودارهاي ١ و ٢).
نمودار ١- مقايسه باکتريهاي مزوفيل توليد کننده آنزيم سلولاز بر اساس ميزان فعاليت CMCase سوپرناتانت کشتهاي ٢٤ ساعته ، ميزان رشد و غلظت پروتئين سوپرناتانت . غلظت پروتئين سلولي نشان دهنده درصد رشد است .
نمودار ٢- مقايسه باکتريهاي ترموفيل توليد کننده آنزيم سلولاز بر اساس ميزان فعاليت CMCase سوپرناتانت کشتهاي ٢٤ ساعته ، ميزان رشد و غلظت پروتئين سوپرناتانت . غلظت پروتئين سلولي نشان دهنده درصد رشد است .
شکل ٣- درخت فيلوژني رابطه بين توالي S rDNA١٦ ايزوله هاي ترموفيل به دست آمده در اين مطالعه و تواليهاي به دست آمده از بانک جهاني ژن را نشان مي دهد.درخت با استفاده از نرم افزار ٥ MEGA به روش neighbor-joining ترسيم شده است .
