بخشی از مقاله
چکیده
این تحقیق به منظور جداسازی باکتری تجزیهکننده تولوئن و تعیین سطح بهینه برای دستیابی به حداکثر درصد تجزیه تولوئن صورت گرفت. در این تحقیق ابتدا اقدام به غنیسازی، جداسازی، خالص سازی و در نهایت شناسایی باکتری تجزیه-کننده تولوئن از خاک آلوده به این ترکیب انجام شد. جدایه به روش مولکولی تعیین توالی 16S rDNA شناسایی گردید. بهینهسازی درصد تجزیه تولوئن با استفاده از روش سطح پاسخ - RSM - صورت گرفت. مطالعات مولکولی انجام شده نشان داد که باکتری جداسازی شده که توانایی رشد و تجزیه تولوئن را داراست Staphylococcus gallinarum ATHH41 میباشد. طرح آماری RSM در شرایط pH معادل 7/68، دمای انکوباسیون 31/73 درجه سانتیگراد و غلظت اولیه معادل 636/04 میلیگرم در لیتر تولوئن، راندمان تجزیه حدود 70/73 درصد را توسط باکتری استافیلوکوکوس گالیناروم سویه ATHH41 پیشبینی نمود و راندمان تجزیه 68/01 درصدی تولوئن توسط این باکتری در شرایط بهینه حاصل شد.
واژه های کلیدی: استافیلوکوکوس گالیناروم، بهینهسازی، تولوئن، روش سطح پاسخ
مقدمه
هیدروکربنهای مونوآروماتیک، از جمله بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و ایزومرهای زایلن - BTEX - ، یک دسته مهم از آلاینده-های زیست محیطی میباشند. این ترکیبات فرار، به دلیل مهاجرت سریع به آب و خاک و به علت سمیت و خاصیت سرطان-زائی، بسیار خطرناک هستند و به طور گسترده به عنوان مواد شیمیایی مختلف در فرآیندهای صنعتی و به مقدار قابل توجهی در سوختهای فسیلی یافت میشوند - اورتگا گونزالس1 و همکاران، . - 2013 در اثر نشت ترکیبات نفتی از تانکهای ذخیره، لولهها و محلهای دفن نامناسب و مواد شیمیایی مصنوعی به شکل علفکشها، آفتکشها و پسابهای صنعتی به محیط وارد میشوند - الناس2 و همکاران، . - 2014 پالایش این ترکیبات با روشهای فیزیکی و شیمیایی گران قیمت است اما پاکسازی زیستی یکی از بیضررترین و آسانترین روشها است و علاوه بر آن که ارزانتر و مقرون به صرفهتر است، یک روش سازگار با محیط زیست بوده و امکان معدنیشدن کامل هیدروکربنهای نفتی را فراهم میکند. بنابراین توجه زیادی به حذف این ترکیبات از محیط زیست توسط تجزیه بیولوژیکی شده است - کائو3 و همکاران، . - 2009
پاکسازی زیستی فرآیندی است که در آن با استفاده از اجزای سلولی یا فعالیتهای متابولیکی میکروارگانیسمها میتوان مواد سمی را از محیط حذف یا به مواد غیرسمی و بیخطر تبدیل کرد - اندرونی و جیانفردا4 ، . - 2007 میکروارگانیسمها همچنین سطح سلول را برای جذب بسترهای آبگریز افزایش داده و در نتیجه جذب آنها را تسهیل مینمایند - میشرا1 و همکاران، . - 2014 تجزیه زیستی تولوئن به بسیاری از عوامل از جمله دما - خلیفت 2 ، - 2006، pH، دوره انکوباسیون، منبع کربن و نیتروژن و سرعت هوادهی حساس میباشد - شوریان3 و همکاران، . - 2009
روش سطح پاسخ - RSM - 4، یکی از ابزارهای موثری است که با کمترین منابع و دادههای کمی، و با طرح آزمایشی مناسب همزمان چندین متغیر را تعیین میکند و از این رو، زمان کمتری صرف میکند. علاوه بر این، روش بهینهسازی یک عامل در یک زمان گران است و اغلب منجر به سوء تعبیر نتایج، زمانی که تعامل بین اجزای مختلف وجود دارد، میگردد - مایرز5 و همکاران، . - 2016 هدف از این مطالعه جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری تجزیهکننده تولوئن از خاک آلوده به نفت و بهینهسازی محیط کشت برای دستیابی به حداکثر تجزیه زیستی تولوئن میباشد.
مواد و روشها
غنیسازی، جداسازی و خالصسازی باکتری تجزیهکننده تولوئن به منظور جداسازی و خالصسازی باکتری تجزیهکننده تولوئن، 10 گرم از نمونه خاک در 90 میلیلیتر محیط کشت اختصاصی - MSM - 6 شامل: NaNO3 4g، KH2PO4 1.5g، Na2HPO4 0.5g، MgSO4.7H2O 0.2g، 0.0011g گرم FeSO4.H2O، CaCl2 0.01g، حاوی 100 میلیگرم در لیتر تولوئن اضافه گردید و pH روی 7 تنظیم شد. در دمای 30 درجه سانتیگراد و سرعت 150 دور در دقیقه به مدت یک هفته در انکوباتور شیکردار انکوبه شد - ژانگ7 و همکاران، . - 2013 پس از غنیسازی، سویه تجزیهکننده تولوئن با انتقال به محیط تولوئن آگار - حاوی محیط پایه نمکی، تولوئن و آگار - و انکوباسیون در دمای 28 درجه سانتیگراد جداسازی شد - وانگ8 و همکاران، . - 2008
شناسایی جدایه انتخابی به روش تعیین توالی 16S rDNA به منظور شناسایی مولکولی جدایه پس از استخراج DNA، بخشی از توالی 16S rDNA با پرایمر رفت 1502F- GGTTACCTTGTTACGACTT و پرایمر برگشت 27R-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG تکثیر شد - مکفرسون و مولر9، . - 2000 دستگاه PCR بر اساس دستورالعمل مادئنو10 و همکاران، - 2011 - برنامهریزی و محصول PCR به مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران ارسال گردید. تعیین توالی DNA به کمک نرمافزار Blast در پایگاه NCBI مورد بررسی و همولوژی آن با اطلاعات موجود در GeneBank مقایسه و ثبت شد.
روش سطح پاسخ
روش بهینهسازی سطح پاسخ - RSM - در واقع مجموعهای از روشهای تجربی، ریاضی و استنتاج آماری است که بهطور فزایندهای برای بهینهسازی در روند مطالعات فنآوری زیستی به کار برده میشود. طرح مرکب مرکزی یکی از معروفترین روشهای طراحی آزمایشات برای بهینهسازی و مدلسازی است. مزیت آن نسبت به روشهای فاکتوریل آن است که، به منظور بهینهسازی عوامل و تخمین سطوح پاسخ، با وجود داشتن دقت مناسب نیازمند تعداد آزمایشات کمتری است - اوزر و گوسر1، . - 2011 Y = b0 + b1X 1 + b2X2 + b3X3+ b11X2 + b22X2 + b33X2 + b12X1X2 + b23X2X3 + b13X1X 3 - 1 - در این معادله Y پاسخ پیشبینی شده؛ b0 ثابت مدل؛ b1، b2، b3 ضریب خطی؛ b11، b22 ، b33 اثرات مربع هر متغیر؛ b12، b13، b23 اثرات متقابل؛ X1، pH؛ X2، دمای انکوباسیون و X3، غلظت اولیه تولوئن هستند - آزامان2 و همکاران، . - 2010 با استفاده از این 3 فاکتور و 5 سطح کد شده - +،+1،1،-0، - - ، با استفاده از نرم افزار 20 Design-Expert 7.1 آزمایش طراحی گردید.
اندازهگیری تولوئن غلظتی معادل با 0/5 مک فارلند از باکتری در محیط پایه نمکی تهیه شد و 10 میکرولیتر از آن به 10 میلیلیتر محیط کشت MSM مایع تلقیح گردید مقادیر مختلف pH، دمای انکوباسیون و غلظت اولیه تولوئن تنظیم شد و به مدت 24 ساعت و با سرعت 150 دور در دقیقه انکوبه شد. سپس نمونهها با سرعت 6000 rpm و به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ گردید به مایع رویی 1 میلیلیتر هگزان اضافه و به شدت تکان داده شد تا تولوئن موجود در محیط کشت در آن حل گردید. در پایان از فاز رویی که حاوی هگزان و تولوئن بود برای اندازهگیری میزان تولوئن در طول موج 262 نانومتر استفاده شد - وانگ و همکاران، . - 2008
نتایج و بحث
بعد از نمونهبرداری از خاک و غنیسازی در محیط کشت MSM حاوی تولوئن سویه باکتری مقاوم به تولوئن جداسازی شد. سویه جداسازی شده کروی، گرم مثبت، کاتالاز و نیترات مثبت و اکسیداز منفی بود. مقایسه توالی 16S rDNA به دست آمده از سویه با توالی موجود در Genebank نشان داد که همولوژی سویه جدا شده با باکتری استافیلوکوکوس گالیناروم3 سویه ATCC 35539 - T - ، 99/9 درصد بوده است. بنابراین سویه به عنوان استافیلوکوکوس گالیناروم سویه 1389 - ATHH41 جفت باز - با شماره دسترسی KX344723 ثبت گردید. شکل 1 درخت فیلوژنیک استافیلوکوکوس گالیناروم سویه ATHH41 را نشان میدهد که با استفاده از نرم افزار - version 5.2 - MEGA رسم گردید - تامورا4 و همکاران، . - 2011 به منظور بهینهسازی پارامترهای موثر بر تجزیه تولوئن از طراحی آزمایشها با روش سطح پاسخ - RSM - استفاده گردید و سطوح بهینه هر پارامتر تعیین شد. آزمایشهای بهینه طراحی شده RSM و تجزیه تولوئن به عنوان سطح پاسخ در جدول 1 آورده شده است. نتایج نشان دادند که حداکثر میزان تجزیه تولوئن توسط باکتری استافیلوکوکوس گالیناروم سویه ATHH41
