بخشی از مقاله
چکیده
تمامی موجودات روي زمین اعم از جانوران، گیاهان و میکروارگانیسم ها در تقابل با هم هستند. این اثر متقابل موجودات به همدیگر منجر به یک سري تغییرات اجباري در آنها شده است. اساس این تغییرات در تکامل و بکارگیري ژن هاي مقابله با عوامل رقیب بوده است. این ژن ها در گیاهان و جانوران در حال حاضر روز به روز شناسایی شده و می توانند به عنوان عوامل مقاومت باشند. یکی از این ژن ها که در طی چند سال اخیر در گیاه مدل آرابیدوپسیس کشف شده، - CERK1 - LysM-RLK1 یا Chitin Elicitor Receptor Like Kinase می باشد. این ژن پروتئینی را کد می کند که در سطح سلول مستقر شده، به طوري که بخش خارجی آن به عنوان حسگر عوامل خارجی عمل می کند. عوامل شناسایی شونده توسط این پروتئین می توانند بیماري زا یا غیر بیماري زا باشند.
پس از شناسایی، سیگنالهاي ایجاد مقاومت به عامل خارجی به درون سلول فرستاده میشود. در این تحقیق cDNA این ژن - CERK1 - از آرابیدوپسیس جداسازي و در وکتوري مناسب کلون و توالی یابی گردید. توالی حاصل عین توالی گزارش شده قبلی آن بود. سپس این ژن در قالب یک وکتور Binary تحت پروموتور 35S قرار گرفت و توسط آگروباکتریوم به گیاه سیب زمینی - رقم آگریا - منتقل گردید. بررسی مقاومت گیاهان تراریخت با ژن CERK1 به چند عامل بیماریزاي قارچی و باکتریایی در دست انجام میباشد. قبلا گزارش شده است که گیاهان آرابیدوپسیس با Overexpression این ژن مقاومت خوبی به قارچها و باکتریها پیدا کرده اند. ایجاد مقاومت با تعبیه حسگر در سطح سلول یکی از موفقترین نوع مقاومتها محسوب میشود.
کلمات کلیدي : LysM-RLK1 ، سیگنال MAPK، مقاومت، بیماري هاي قارچی و باکتریایی
مقدمه
گیاهان موجودات ساکنی هستند که دائما در معرض دامنه ي وسیعی از ارگانیسم هاي خاکزي و هوازي همچون باکتریها، قارچ ها، ویروس ها، حشرات و نماتدها میباشند. با توجه به اینکه برخی از این ارگانیسم ها می توانند مفید یا مضر باشند، گیاهان به یک سیستم شناسایی عوامل مفید و مضر از هم نیاز دارند تا پاسخ هاي مفید و سریع را در مقابل این عوامل از خود نشان دهند. گیاهان شدیدا با ارگانیسم هاي فرصت طلبی که مایلند بر روي این منابع غذایی مطمئن تغذیه کنند در مقابله هستند. چنین رفتارهایی به ایجاد مکانیسم هاي دفاعی که در دو دسته ي اصلی طبقه بندي می شوند، منجر شده است.
موانع فیزیکی در گیاهان که آنها را از دامنه وسیعی ازمزاحمان بالقوه حفاظت می کنند و در سطح دوم ترکیبی از سیستم ایمنی ذاتی که می تواند متعاقب فعال سازي سنسورهاي مختلف، تحریک شود. بخشی از این سیستم هاي ایمنی به پروتئین هاي سطح سلولی بر می گردد، که ساختار و عملکرد متفاوتی نسبت به رسپتورهاي عادي که در سطح سلول هستند و نقش انتقال3 - ، - 78 - ، - 6مواد را انجام می دهند، دارند. نمونه اي از این ژنها در آرابیدوپسیس شناسایی شده و LysM-RLK1 نام دارد. ژن CERK1، 2998 نوکلئوتید دارد با 11 اینترون و یک توالی کد کننده 1854 نوکلئوتیدي. این ژن یک پروتئین 617 LysM-RLK1 اسید آمینه اي کد می کند که داراي یک Domain خارج سلولی شامل سه موتیف Lys، یک Domain تراغشایی و یک Domain کیناز سرین/ترئونین درونسلولی است.
این پروتئین طی یک سري مکانیسم هاي مولکولی داخل سلولی تولید شده و در سطح سلول مستقر می شود. ابتدا، عواملغیرخودي یا خودي مضر که اصطلاحا Pathogen/microbial/damage-Associated molecular - PAMP/MAMP/DAMP - 5 - - pattern نامیده میشوند، توسط بخش خارج سلولی که سه موتیف لیزین را شامل می شود، دریافت شده، و از طریق بخش تراغشایی، به قسمت داخل سلولی که بخش کینازي این پروتئین هست، ارسال می شود. قسمت داخل سلولی یک سري واکنش هاي فسفریلاسیون را از طریق آبشارهایی موسوم به MAPK - پروتئین کیناز فعال شده توسط میتوژن - راه اندازي می کند. سه نوع MAPK شناسایی شده که به ترتیب عمل عبارتند از MAPKKK، MAPKK و .MAPK آخرین MAPK بعد از فسفریله شدن، وارد هسته ي سلول شده و در هسته فسفریلاسیون فاکتورهاي مختلف دخیل در رونویسی ژن هاي مقاومت را بر عهده می گیرد.
این فسفریلاسیون باعث بیان ژن هایی از جمله ژن هاي تولید کیتیناز شده که این کیتیناز باعث تخریب کیتین موجود در دیواره ي سلولی قارچ میشود. از طرف دیگر به علت شباهتی کهکیتین دیواره ي قارچ ها با پپتیدوگلیکان باکتریایی دارد مشخص شده که موتیف هاي خارج سلولی CERK1 قابلیت شناسایی PAMPهايباکتریایی را نیز دارد و بنابراین می تواند عاملی براي القا مقاومت در مقابل پاتوژن هاي باکتریایی نیز باشد - 2و. - 1 گیاهان آرابیدوپسیس موتان در این ژن حساسیت زیادي به قارچها و باکتریها داشتند و با انتقال این ژن به گیاهان موتان مقاومت در برابر آنها حاصل شده است . - 8 -
مواد و روش ها
ابتدا اقدام به ساخت cDNA از روي mRNA استخراج شده از گیاه مدل آرابیدوپسیس تالیانا - Arabidopsis thaliana - گردید. براي این کار نیم گرم برگ گیاه آرابیدوپسیس تالیانا با استفاده از ازت مایع در هاون پودر گردید و RNA کل از بافت گیاه استخراج گردید. بعد از استخراج RNA کل با استفاده از اسپکتروفتومتر کمیت و روي ژل آگارز کیفیت RNA استخراج شده تعیین شد.ساخت DNA مکمل RNA : - cDNA - کل استخراج شده حاوي mRNA و tRNA و rRNA می باشد با توجه به اینکه یکی از خصوصیات mRNA داشتن دم پلی A می باشد از این خصوصیت استفاده گردید و با استفاده از آغازگر الیگو - dT - و آنزیم رونویسی معکوس - superscript III RT, Invitrogene - ، از RNA استخراج شده بافت گیاهی دو ساعت در دماي 37°C، DNA مکمل - cDNA - تک رشته اي ساخته شد. در این مرحله از RNase inhibitor استفاده شد.
تکثیر ژن با :PCR با یک جفت آغازگر اختصاصی XbaI-F: aaTCTAGAggATGAAGCTAAAGATTTCTCTAATCGC - و - BamHI-R: ggGGATCCCTACCGGCCGGACATAAGACTGAC و به کمک دستگاه ترموسایکلر cDNA مربوط به ژنCERK1 دو رشته اي و تکثیر شد. براي جفت پرایمر مکان برشی براي آنزیم هاي XbaI و BamHI در نظر گرفته شد تا در کلون کردن از آنزیمهاي برشی مربوطه استفاده شود. براي کلونینگ ژن CERK1 ابتدا PCR انجام و سپس مقداري از آن بر روي ژل آگارز الکتروفورز گردید تا با توجه به اندازه ي ژن در صورت تایید بقیه PCR خالص سازي شود.کلونینگ در وکتور: محصول PCR و همچنین وکتور pKS با آنزیمهاي XbaI و BamHI برش یافته و پس از خالص سازي روي ژل LMP ژن CERK1 در این وکتور وارد گردید. لیگاسیون با استفاده از آنزیم T4DNA Ligase انجام شد.محصول لیگاسیون در داخل باکتري اشرشیاکولاي سویه Top10 از طریق الکتروپوراسیون ترانسفورم شد و در داخل آون به مدت یک شب در 37 درجه نگهداري گردید.
روز بعد، کلونی هاي تشکیل شده کشت مایع شده و از آنها پلاسمید استخراج گردید. پس از تایید درستی پلاسمیدها با PCR تیمار RNaseروي آنها انجام و جهت توالی یابی به انستیتو بیولوژي مولکولی گیاهی استراسبورگ فرانسه ارسال شد. بعد از بررسی توالیها و بلاست آنها با توالی گزارش شده قبلی، از وکتور PKS-CERK1 با برش آنزیمی توسط XbaI و BamHI ژن از وکتور جدا - شکل - 1 و در وکتور pBin61 مقابل پروموتور 35S جاي گرفت - شکل . - 2 پس از تایید این وکتور در باکتري تکثیر گردید.ترانسفورماسیون گیاه: در این مرحله وکتور pBin61-CERK1 با الکتروپوراسیون به آگروباکتریوم منتقل و این باکتري کشت شده و از توانایی آن براي انتقال T-DNA به گیاهان سیب زمینی استفاده گردید. گیاهچه هاي حاصل تراریخت روي محیط حاوي کانامایسین گزینش شده و در شرایط درون شیشه اي تکثیر یافتند.
نتایج
در دو دهه اخیر تولید گیاهان زراعی و باغی مقاوم به پاتوژنها با روشهاي گوناگونی مشغله اصلی محققان کشاورزي و بیولوژي بوده است. با ظهور بیوتکنولوژي و متدهاي سریع و بدون محدودیت انتقال ژن به گیاهان، این امر سرعت یافته و شاهد معرفی واریته هاي مقاوم گیاهی به بیماریهاي قارچی، باکتریایی و ویروسی هستیم. این در حالی است که بیشتر این تحقیقات بدون اطلاعات کافی و جامع از عملکرد ژنها و مکانیسمهاي دخیل صورت گرفته است. خوشبختانه بیولوژي مولکولی روز به روز به اطلاعات موجود در خصوص ژنها و وظایف اصلی و فرعی انها میافزاید. ژن CERK1 یکی از این ژنهاست که اخیرا تحقیقات بسیاري روي آن انجام پذیرفته و ثابت شده است که یک پروتئین گیرنده و سه بخشی در سطح سلول میباشد و به محض دریافت و چسبیدن به کیتین سیگنالهایی بصورت فسفریلاسیون به پایین دست خود انتقال و موجب روشن شدن برخی ژنها ازجمله کیتیناز در سلول میشود 7 - ،. - 8
این ژن یک کاندیدا خوبی براي ایجاد مقاومت به قارچهاي پاتوژن میتواند باشد. مزیت استفاده از این ژن در ایجاد مقاومت این است که سیستمهاي مقاومت بطور یکنواخت در گیاه روشن نیست و تنها با حضور پاتوژن روشن خواهد شد و با نبود آن نیز خاموش میگردد. بنابراین گیاه مدام درگیر در تولید پروتئینهاي مقاومت که اکثرا آنزیمهاي مخربی هستند نمی باشد. در این تحقیق ژن CERK1 از گیاه مدل آرابیدوپسیس جداسازي و در وکتور بیناري مناسب ترانسفورماسیون گیاه با آگروباکتریوم کلون شد - شکل . - 2 آگروباکتریومهاي حاوي وکتور حامل این ژن در معرض سلولهاي برگ سیب زمینی قرار گرفته و T-DNA به آنها منتقل گردید. گیاهان بازیافت شده حاوي این ژن با PCR براي اثبات حضور ژن و با RT-PCR براي اثبات بیان شدن آن بررسی می شوند. تکثیر این گیاهان در حال انجام میباشد تا مقاومت آنها به برخی پاتوژنهاي قارچی و باکتریاي مورد مطالعه قرار گیرد.
