بخشی از مقاله
مقدمه:
هلیکوباکتر پیلوري در مخاط معده انسان کلنیزه و باعث ایجاد طیفی از بیماریهاي معدي شامل سرطان، زخم معده و سایر اختلالات دستگاه گوارشی می گردد. . یکی از دلایل تنوع بیماري گوارشی در افراد مبتلا به H. pylori ناهمگون بودن ساختار ژنتیکی این باکتري است. در سطح ژنتیکی این باکتري تنوع بالایی را از خود نشان می دهد . ژنوتایپ و انتشار جغرافیایی هلیکوباکترپیلوري با میزان شدت بیماري زخم معده - - peptic ulcer در ارتباط است . گونه هاي هلیکوباکتر پیلوري که آنتی ژن CagA را کد می کنند، به دلیل تحریک پاسخهاي التهابی اساسا با بیماري هاي گاسترودئودنال جدي تري نسبت به سویه هایی که این آنتی ژن را کد نمی کنند همراه هستند.
ژن cagA از نظر اندازه در بین کشورهاي غربی و شرقی متفاوت است که این تفاوت ناشی از حضور تعداد توالی تکرار شونده در انتهاي3′ ژن cagA می باشد - . - 2 فسفریلیشن تیروزین پروتئین CagA که در موتیفهاي منحصر به فرد EPIYA وجود دارد نقش بسیار مهمی را در بیماري زایی این باکتري ایفا می کند. همچنین مشخص شده است گونه هایی که داراي CagA با تعداد بالایی از تکرار این موتیفها هستندبه سرطان معده نزدیکترند - . - 3
با توجه به اینکه میزان فسفوریلیشن CagA بستگی به تعداد میزان نواحی EPIYA دارد و توالی کد کننده این نواحی در انتهاي 3′ ژن cagA قرار گرفته است می توان نتیجه گرفت که جداسازي و کلون کامل ژنcagA وسکانس کردن وتعیین توالی دقیق آن در سویه هاي ایرانی با توجه به تنوع ژنتیکی H. pylori وژنcagA بر حسب نواحی جغرافیایی به منظور تفسیر مکانیسم بیماري زایی این باکتري در ایران ضروري است.
مواد و روشها :
شرایط کشت و نگهداري باکتري : گونه هاي H. pylori برروي محیط کشت BHI - Brain Heart Infusion Agar - همراه با %10 خون گوسفندي دفیبرینه در شرایط میکروائروفیلیک در انکوباتور co2 دار در دماي37 ° کشت ودر روز سوم ، پنجم و هفتم بررسی شدند. همچنین به منظور ترنسفورمیشن و استخراج پلاسمید، باکتریهاي XL10-GoldوDH5α در محیط - Luria Bertani - LB Broth همراه با ampicilin با غلظت100mg/ml در انکوباتر شیکر دار در دماي37 ° به مدت 16 تا 18 ساعت کشت داده شدند.
به منظور نگهداري طولانی مدت H. pylori هاي کشت داده شده از محیط Skim Milk همراه با گلیسرول و براي نگهداري باکتري XL10-Gold از محیط LB Broth به همراه %15 گلیسرول استفاده گردید. باکتري هاي مذکور در دماي -70 نگهداري شدند. استخراج DNA ژنومیک و پلاسمید: براي استخراج DNA ي H. pylori از دو روش boiling و kit استفاده گردید، در روش boiling ابتدا کلنی در 700ul آب حل و سپس با استفاده از حرارت DNA باکتري استخراج گردید همچنین به منظور تعیین میزان اهمیت درجه خلوص DNA در عمل cloning از kit QIAgen براي جداسازي DNA استفاده شد.
به منظور استخراج پلاسمید از باکتري ابتدا 5ml از محیط LB broth که حاوي باکتري حمل کننده پلاسمید بوددر دماي 4 °c سانتریفوژ گردید سپس رسوب ایجاد شده به منظور استخراج پلاسمید بوسیله kit QIAGen مورد استفاده قرار گرفت. طراحی پرایمر و واکنش :PCR یک جفت پرایمر شامل سایت برش مربوط به آنزیم BamHI در ناحیه 5′ وسایت برش مربوط به آنزیم XhoI در ناحیه 3′ براساس توالی ژن cagA موجود در NCBI طراحی شد.
واکنش Long PCR در حجم نهایی 25ul در میکروتیوپهاي 0.2ml با استفاده از کیت high fidelity roche در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. میزان محصول PCR استفاده شده براي انجام عمل کلونینگ 100ul بوده است ساخت پلاسمید نوترکیب و عمل ترنسفورمیشن : به منظور ساخت پلاسمید نوترکیب محصول PCR پس از تخلیص بوسیله کیتPCR Product Purification با استفاده از دو آنزیم XhoI وBamH I در دماي 37 درجه ، در مدت 4 ساعت بریده شد. همچنین این عمل براي پلاسمید pET21 نیز تکرارگردید سپس با استفاده از آنزیم T4 لیگاز با نسبت 6:1 براي پلاسمید وقطعه الحاقی در دماي16 ° به مدت یک شبانه روز عمل ligation صورت گرفت.همچنین به منظور عمل ترنسفورمیشن از روش دستی کلرید منیزیم استفاده شد.
استخراج پلاسمید نوترکیب و تایید کلونینگ: به منظور اسخراج پلاسمید نوترکیب،تک کلنی هاي رشد کرده بر روي محیط LB آگاردر محیط LB broth حاوي آمپی سیلین به مدت 16 ساعت در انکوباتور شیکردار کشت و سپس پلاسمید مورد نظر بر حسب دستور العمل کیت استخراج پلاسمید QIAGen تخلیص و جداسازي شد. تایید کلون شدن ژن مورد نظردر پلاسمید pET21 بوسیله آنزیم هاي محدود الاثر صورت گرفت. سکانس وتعیین توالی ژن : cagA تعیین توالی ژن cagA در پلاسمید نوترکیب ساخته شده،بوسیله دستگاه sequencer 3130X در مرکز تحققات کبد وگوارش بیمارستان طالقانی انجام و بوسیله نرم افزار chromas تفسیرگردید .
بحث ونتیجه گیري:
هلیکو باکتر پیلوري یکی از شایعترین عوامل عفونتهاي مزمن معدي است که بیش از %50 جمعیت انسانی را الوده کرده است. میزان شیوع این باکتري در بیماران ایرانی در حدود %80 می باشد . - 4 - همان گونه که اشاره شد یکی از مهمترین عوامل شناخته شده بیماریزایی هلیکوباکتر پیلوري ژن cagA می باشد. ژن cagA بوسیله پرایمرهایی که در بالا عنوان شد سنتز وبرروي ژل %1 بوسیله لامپ UV مشاهده گردید.اندازه باند همانطور که انتظار می رفت 3560 bp بود که نشاندهنده تکثیر کامل ژن cagA بود - شکل. - 1a این قطعه با استفاده از آنزیمهاي محدودالاثر BamH I وXho I هضم و پس از آن آنزیم هاي مذکور غیرفعال شدند تمام این موارد به صورت همزمان براي پلاسمید نیز تکرار گردید.
با انجام عمل ligation و ترنسفورمیشن، پلاسمید نوترکیب وارد باکتریهاي XGold و DH5α شده و با انجام عمل PCR کلونی و بررسی محصول PCR بر روي ژل %1 باند 3560bp مشاهده گردید که نشاندهنده کلون شدن قطعه مورد نظر در پلاسمید pET21 بود - شکل. - 1b پس از آن نتیجه بدست آمده بوسیله آنزیم هاي محدودالاثر و سکانس کردن توالی مورد نظر تایید شد.با توجه به استفاده از دو نوع باکتري X Gold و DH5α در عمل ترنسفورمیشن و استخراج DNA با دو روش boiling وKit که انجام موفقیت آمیز عمل کلونینگ از هر دو طریق و در هر دو باکتري را به دنبال داشت می توان نتیجه گرفت که نوع روش استخراج DNA و باکتري استفاده شده در این مطالعه تاثیر بسزایی در عمل کلونینگ نداشته است.
