بخشی از مقاله
چکیده
زیر واحد آلفا، بخش مشترك هورمونهاي گلیکوپروتئینی بخش قدامی هیپوفیز می باشد که با پیوند غیر کوالان به زیر واحد بتاي اختصاصی هر یک از این هورمونها متصل می گردد. این مطالعه به منظور جداسازي ناحیه کد کننده زنجیره آلفاي هورمونهاي گلیکوپروتئینی هیپوفیز از بافت جفت انسانی انجام شده است.RNAي تام از بافت جفت جدا شد و cDNA از طریق RT-PCR سنتز گردید. با کمک یک جفت پرایمر قطعه اي شامل ناحیه کامل کد کننده زنجیره آلفا آمپلیفیه گردید. این قطعه پس از Ligation با pTZ57R/T به درون سلول E.coli ترانسفورم گردید. از تعدادي از کلونهاي ترانسفورم شده پلاسمید تخلیص و پلاسمیدهاي تأیید شده با روش Restriction analysis، نهایتاً تعیین توالی صورت گرفت. نتایج تعیین توالی تطابق کامل این ژن را با ژنهاي گزارش شده در GenBank نشان می دهد. ژن زنجیره آلفا قادر است جهت فیوژن با زیر واحدهاي بتاي هر یک از هورمونهاي گلیکوپروتئینی هیپوفیز به منظور تهیه هورمونهاي نوترکیب بکار رود. در ادامه مطالعه این ژن به زیر واحد بتاي هورمون FSH انسانی جهت تولید این هورمون در میزبانهاي یوکاریوتیک متصل خواهد شد.
واژگان کلیدي: Cloning , alpha subunit , Follicle Stimulating Hormone
مقدمه:
هورمونهاي گلیکوپروتئینی بخش پیشین غدهء هیپوفیز شامل FSH, LH, TSH, HCG هترودیمرهایی هستند که از دو زیر واحد پلی پپتید گلیکوزیله به نام آلفا و بتا تشکیل شده اند - 2و4و. - 12 این دو واحد با یک پیوند غیرکووالان به سختی به یکدیگر متصل شده و ساختمان سه بعدي آنها به وسیلهء پیوندهاي دي سولفیدي داخلی حفظ می گردد - 6و8و. - 10 زیر واحد بتا از نظر اسیدهاي آمینه و جزءکربوهیدراتی در هورمونهاي فوق متفاوت بوده و عامل اختصاصی بودن این هورمونها و جزء تعیین کننده فعالیت بیولوژیکی آنها به شمار می رود - 9و. - 11 زیرواحد آلفا که در موقعیت کروموزومی 6p21.1-13 واقع شده داراي 92 اسید آمینه با 5 پل دي سولفیدي - S-S - است و در هر چهار هورمون فوق یکسان می باشد.
یک قطعه پیش ساز واحد، نسخه برداري ژن آلفا را در جفت و هیپوفیز تنظیم می نماید این زیر واحد شامل چهار اگزون و سه اینترون می باشد که اگزون یک و بخش انتهایی اگزون چهار بیان نمی شود. سیگنال سکانس زیرواحد آلفا شامل 72 نوکلئوتید می باشد که در سمت 5´ اگزون دو قرار دارد - 1و3و. - 5 محققین از روشهاي مختلف ژن زیر واحد آلفا را جدا کرده اند. Mannaerts وهمکاران در سال 1991 این ژن را از طریق تهیه یک کتابخانه ژنیومیک حاصل از بافت جفت بدست آوردند - . - 7 این مطالعه به منظور جداسازي ناحیه کد کننده زنجیره آلفاي هورمونهاي گلیکوپروتئینی هیپوفیز از بافت جفت انسانی از طریق cDNA انجام شده است.
مواد و روشها:
در طی یک عمل سزارین بافت جفت جدا و در شرایط کاملاً استریل و سرد به محیط آزمایشگاه منتقل گردید. RNAي تام به روش Affenity chromatography جدا شد و با استفاده از راندوم هگزانوکلئوتید پرایمر، cDNA از طریق RT-PCR سنتز گردید. با کمک پرایمرهاي E2F و E4R یک قطعه 351 نوکلئوتیدي شامل اگزون دو، اگزون سه و بخش ترجمه شونده اگزون چهار آمپلیفیه گردید - شکل . - 1 این قطعه پس از کلونینگ در pTZ57R/T به درون سلولَ TOP 10 F ترانسفورم گردید. بررسی کلونها از طریق تخلیص پلاسمید، Restriction analysis و نهایتاً تعیین توالی انجام شد.
نتایج و بحث:
از کلونهاي بدست آمده چهار کلون که از نظر اندازه پلاسمید مورد انتظار بودند انتخاب شدند و آنالیز آنزیمی با استفاده از آنزیم XbaI نشان داد که سه کلون واجد ژن زیر واحد آلفا می باشند - شکل . - 2 از بین این کلونها دو کلون انتخاب و تعیین توالی گردید که نتایج تعیین توالی تطابق کامل این ژن را در هر دو کلون با ژن ثبت شده در GenBank و تطابق صد در صد پروتئین مربوطه را نشان می دهد. از آنجا که زنجیره آلفا در هر چهار هورمون گلیکوپروتئینی هیپوفیز قدامی مشترك می باشد این ژن قادر است جهت فیوژن با زیر واحدهاي بتاي هر یک از هورمونهاي گلیکوپروتئینی هیپوفیز به منظور تهیه هورمونهاي نوترکیب بکار رود. در ادامه مطالعه این ژن به زیر واحد بتاي هورمون FSH انسانی جهت تولید این هورمون در میزبانهاي یوکاریوتیک متصل خواهد شد.
تشکر و قدردانی:
این طرح با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی سمنان و شبکه بیوتکنولوژي کشورانجام شده است. محققین از انستیتو پاستور ایران به خاطر همکاري علمی در این زمینه کمال تشکر را دارند.
