مقاله جداسازی لاکتیک اسید باکتری های تولید کننده پلی هیدروکسی آلکانوات ها از منابع طبیعی

بخشی از مقاله

چکیده:

هدف از انجام این تحقیق جداسازی لاکتیک اسید باکتریهایی با توانایی تولید بیوپلاستیک میباشد. دلیل انتخاب این گروه از باکتریها، تواناییشان در استفاده از ضایعات کارخانجات لبنی و کاهش هزینه تولید این بیوپلیمر است. در این تحقیق از 63 نمونه منابع طبیعی، برای جداسازی باکتریها استفاده شد و 85 باکتری ایزوله شد که با رنگ سودان بلک بی و نایل رد، 25 ایزوله تولید کننده این بیوپلیمر انتخاب شدند. بر اساس نتایج آزمون استخراج PHA، باکتریهایی با بیشترین میزان تولید، به منظور شناسایی فنوتیپی و ژنوتیپی و بهینه سازی شرایط انتخاب شدند. تولید PHA برای لاکتیک اسید باکتریها در محلول آب پنیر به عنوان محیط پایه حاوی 1/5، 3 و %4/5 ملاس بررسی شد. همه لاکتیک اسید باکتریها، بالاترین میزان تولید را در 72 ساعت و %4/5 ملاس نشان دادند که برای ایزوله های مختلف بین 10 تا %30 وزن خشک سلول متغیر بود.

واژه های کلیدی: پلی هیدروکسی آلکانوات ها، لاکتیک اسید باکتری ها، آب پنیر، ملاس

مقدمه:

پلی هیدروکسی آلکانوات ها پلی مرهایی شبیه پلاستیک هستند که به طور طبیعی به وسیله بسیاری از باکتری ها تولید می شوند. این ترکیبات در میان نوید بخش ترین پلاستیک های نسل آینده هستند. این ها پلی استرهای بیولوژیکی با وزن مولکولی بالا هستند که توسط انواع مختلف باکتری ها تولید می شوند و به عنوان منبع ذخیره کربن و انرژی برای باکتری هستند. در شرایطی که برای رشد مناسب نیست، در صورت محدود بودن منبع نیتروژنی و در دسترس بودن منبع کربنی، تولید PHA شروع می شود. بسیاری از باکتری ها به مسیرهای متابولیکی پیچیده ای مجهز هستند که منبع کربن زیاد را به -3 ، -4 ، و -5هیدروکسی آلکانویل-کوآنزیم آ تبدیل می کنند. آنزیمی به نام PHA سنتز پلی مراز، ترکیبات هیدروکسی آلکانویل کوآنزیم آ را به مولکول های پلی استر خطی با جرم مولکولی 0/05-20 میلیون دالتون تبدیل می کند. مولکول های بی شکل حاصل، به طور همزمان به حالت گرانول های نامحلول در آب بسته بندی می شوند و در سیتوپلاسم سلول نگه داشته می شوند.

صرف نظر از طبیعی یا غیرطبیعی بودن PHA، آن ها بر اساس تعداد کربن در مونومرشان به سه دسته تقسیم می شوند. اگر تعداد کربن کمتر از 6 باشد، به آن ها PHA زنجیر کوتاه، اگر بین 14-6 کربن باشد، PHA زنجیر متوسط و اگر بیشتر از 14 کربن باشد، PHA زنجیر بلند می گویند. سنتز موفق PHA، نه تنها به نوع میکروارگانیسم مورد استفاده، بلکه، به شرایط تغذیه ای بستگی دارد. انتخاب منبع کربنی مناسب یکی از فاکتورهای کلیدی برای کاهش هزینه تولید PHA است. مطالعات تخمین زده اند که سهم هزینه سوبسترا تقریباً %50-28 در مقایسه با کل هزینه تولید استبنابراین،. منابع کربنی مناسب و نسبتاً ارزان باید شناسایی شوند تا تولید مقرون به صرفه PHA را به بیشترین حد برسانند . - Sudesh and Abe, 2010 - این ترکیبات با نام تجاری بیوپل ،نوداکس و دگراپل - Philip et al., 2007 - در بازار موجود هستند. به این پلیمرهای تجزیه پذیر، پلاستیک سبز می گویند . - Reddy et al., 2003 -

مواد و روش ها:
.1 جمع آوری نمونه ها برای جداسازی این گروه از باکتری ها از 63 نمونه از گیاهان، محصولات تخمیری و میوه های سالم و ناسالم استفاده شد.

.2 جداسازی لاکتیک اسید باکتری ها 10 گرم از نمونه در 90 میلی لیتر محلول سیلین ریخته شد. نمونه به خوبی هم زده شد. پس از ته نشین شدن، 1 میلی لیتر از مایع رویی در 9 میلی لیتر محلول سیلین استریل ریخته شد و رقیق سازی ده دهی انجام شد. از چند سری آخر رقیق سازی، روی محیط MRS agar استریل کشت داده شد و در 37 C به مدت 2 روز در شرایط بی هوازی انکوبه شد . - Jagadeeswari et al., 2010 -

.3 رنگ آمیزی با رنگ سودان بلک بی در ابتدا، لاکتیک اسید باکتری ها روی محیط TSA استریل حاوی %2 گلوکز کشت داده شدند و 72 ساعت در دمای 37 C انکوبه شدند. بعد از این مدت، 8 میلی لیتر محلول %0/2 رنگ سودان بلک بی در اتانول %96 روی پلیت حاوی کلنی ریخته شد. بعد از 10 دقیقه رنگ دور ریخته شد و پلیت با 10 میلی لیتر اتانول %96 شسته شد . - Ghate et al., 2011 -

.4 رنگ آمیزی با رنگ نایل رد رنگ نایل رد در دی متیل سولفوکسید به خوبی حل شد و سپس با غلظت 0/5 ʽg/ml به محیط کشت TSA حاوی %2 گلوکز اضافه شد. باکتری ها کشت داده شدند. پس از رشد کلنیها، پلیت ها به صورت مستقیم در دستگاه UV transilluminator در معرض نور ماوراء بنفش قرار گرفتند . - Spiekermann et al., 1999 - در تمام مراحل کار از رالستنشیا یوتروفا به عنوان باکتری کنترل مثبت و از اشرشیاکلای و مخمر ساکارومایسز سرویزیه به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

.5 انتخاب باکتری های تولید کننده پلی هیدروکسی آلکانوات ها با استفاده از روش کمی - استخراج - PHA لاکتیک اسید باکتریها درون محیط TSB حاوی %2 گلوکز، به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. سپس در 2800rpm به مدت 10 دقیقه سانترفیوژ شدند و رسوب حاصل با خشک کن انجمادی خشک شد. وزن خشک سلول ها اندازه گیری شد . - Ksecdau et al., 2003 - مقدار مساوی از سلولهای ارگانیسم-های مختلف 20 - میلی گرم - ، در 5 میلی لیتر سدیم هیپوکلریت به خوبی پخش شد. بعد از یک ساعت انکوبه شدن در 37 C سلولها کاملاً هضم می شوند. گرانول های PHA با سانترفیوژ کردن در دور 10000rpm به مدت 3 دقیقه جمع شدند. رسوب با آب مقطر، استون و اتانول شسته شد و نهایی ترین رسوب باقی مانده بعد از سانترفیوژ، در کلروفرم حل شد. کلروفرم در دمای اتاق تبخیر شد. سپس روی باقی مانده، اسید سولفوریک %97-95 ریخته و 1 ساعت در 80 C حرارت داده شد. بعد از سرد شدن نمونه ها، جذب در 235nm خوانده شد. محلول شاهد، اسید سولفوریک است . - Ribera et al., 2001 -

.6 بررسی ویژگی های فنوتیپی جدایه های لاکتیک اسید باکتری توانایی تولید گاز از گلوکز، رشد در دماهای مختلف، رشد در غلظت های مختلف نمک و الگوی تخمیر کربوهیدرات ها انجام شد.

.7 بررسی ویژگی های ژنوتیپی ایزوله ها از پرایمر عمومی با 1200 جفت باز استفاده شد. توالی پرایمر - 5"-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3" - fDI و 5"- - rDI - ACGGCTTACCTTGTTACGACTT-3" است. واکنش زنجیره ای پلی مراز با پرایمر عمومی با چرخه واسرشته سازی اولیه در 94 C به مدت 5 دقیقه شروع می شود. سپس 35 چرخه با شرایط زیر تکرار شد. مرحله واسرشته سازی در 94 C به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال پرایمرها به رشته های DNA در دمای 47 C به مدت 30 ثانیه، بسط در دمای 72 C به مدت 1 دقیقهنهایتاً. یک چرخه بسط نهایی در دمای 72 C به مدت 10 دقیقه انجام شد. مجموع 35 چرخه، 1 ساعت و 51 دقیقه زمان برد.

.8 بهینه سازی شرایط برای باکتری های شناسایی شده به منظور تولید پلی هیدروکسی آلکانوات ها محلول %10 پروتئین آب پنیر به عنوان محیط پایه و ملاس به عنوان منبع کربنی انتخاب شد. ملاس با غلظت های 1/5، 3 و %4/5 به محلول پروتئین آب پنیر افزوده شد. در ابتدا باکتری ها در محیط MRS تلقیح شدند و 24 ساعت در دمای 37 C قرار داده شدند و سپس به 100 میلی لیتر از محیط زیر افزوده شدند و 24، 48 و 72 ساعت در دمای 37 C قرار گرفتند. محلول پروتئین آب پنیر و ملاس، جداگانه استریل شدند. ملاس به اندازه ای به محیط پایه افزوده شد تا در 100 میلی لیتر از محیط، غلظت های نهایی مورد نظر حاصل شود.

نتایج و بحث:
.1 جداسازی باکتری های باسیلوس و لاکتیک اسید باکتری ها از نمونه های نام برده در نهایت 83 ایزوله از محیط MRS جدا شدند.

.2 رنگ آمیزی با رنگ سودان بلک بی سودان بلک بی، رنگی چربی دوست - لیپوفیل - است. زمانی که سلول های باکتریایی در معرض این رنگ قرار می گیرند، رنگ جذب اندام های لیپیدی درون سیتوپلاسم سلول می شود و آن ها را رنگ می کند. به علاوه، این رنگ می تواند قسمت های دیگری از ساختار سلول به خصوص غشای سیتوپلاسمی بعضی از باکتری ها را رنگ کند. بنابراین سودان بلک بی می تواند جذب ترکیبات PHA درون سلول شود و سلول حاوی این ترکیبات را آبی پررنگ یا مشکی کند. این رنگ حلالیت بالایی در اتانول دارد.

.3 رنگ آمیزی با رنگ نایل رد با رنگ آمیزی ساده می توان PHA درون سلول های باکتریایی را با حساسیت بالایی تشخیص داد. بهتر است این رنگ با غلظت 0/5 ʽg/ml به محیط کشت افزوده شود تا رشد سلول در حضور آن اتفاق بیفتد. به این ترتیب، تشخیص سلول های تولید کننده PHA از سایرین با دقت بالاتری انجام می پذیرد. حضور این رنگ در محیط کشت، رشد باکتری را تحت تأثیر قرار نمی دهد؛ به علاوه، روی نرخ انباشته شدن PHA هم تأثیری ندارد - Spiekermann et al., .1999 - با توجه به نتایج دو روش رنگ آمیزی، 22 ایزوله میله ای، 3 ایزوله کوکسی انتخاب شدند.

.4 انتخاب باکتری های تولید کننده پلی هیدروکسی آلکانوات ها با استفاده از روش کمی - استخراج - PHA برای استخراج PHA، روش های مختلفی وجود دارد. روش استخراج با حلال - کلروفرم - ، برای استخراج PHA در سطح آزمایشگاهی به کار می رود چون به طور معمول، مقدار زیادی حلال مورد استفاده قرار می گیرد . - Sudesh and Abe, 2010 - سدیم هیپوکلریت، ترکیبات غشای سلولی و تا حد امکان سایر ترکیبات غیر از PHA را تجزیه و در خود حل می کند و به این ترتیب، جداسازی گرانول های PHA را ممکن می سازد. مراحل شستشو با آب، استون و اتانول اهمیت زیادی در خارج شدن ترکیبات باقی مانده غیر از PHA دارند. این 3 محلول، تأثیری روی PHA ندارند و فقط ترکیبات اضافی باقی مانده در رسوب PHA را خارج می کنند. استون و اتانول، نه تنها پلی مر را در خود حل نمی کنند بلکه به رسوب آن هم کمک می کنند . - Suriyamongkol, 2007 - با توجه به نتایج بدست آمده از جذب محلول ها در 235nm و مطابقت با منحنی استاندارد کروتونیک اسید، باکتری هایی را که بیشترین میزان PHA تولید کردند، به منظور شناسایی فنوتیپی و ژنوتیپی و بهینه سازی شرایط انتخاب شدند. بر اساس نتایج حاصل از این آزمون، 4 ایزوله لاکتیک اسید باکتری میله ای و یک ایزوله لاکتیک اسید باکتری کوکسی انتخاب شد.

.5 باکتری های شناسایی شده به روش فنوتیپی و ژنوتیپی با توجه به نتایج توالی یابی ژنی و مطابقت با آزمون های بیوشیمیایی مجود در کتاب برگی ایزوله های منتخب به صورت زیر نام گذاری شدند.

.6 بهینه سازی شرایط برای باکتری های شناسایی شده به منظور تولید پلی هیدروکسی آلکانوات ها دلیل انتخاب لاکتیک اسید باکتری ها به منظور تولید PHA، علی رغم تنها گزارش در مورد این باکتری ها در محیط ام آر اس و پایین بودن میزان تولید نسبت به سایر گروه های میکروارگانیسم ها، توانایی این میکروارگانیسم ها در استفاده از ضایعات کارخانجات لبنی است. بیشتر گروه های باکتریایی به علت pH پایین این محصول، توانایی رشد ندارند ولی لاکتیک اسید باکتری ها به خوبی در این محیط رشد و از منبع کربنی آن استفاده می کنند و PHA