بخشی از مقاله
چکیده
نانوذرات موضوع مقالات متعدد و گزارشات میباشند ونوید تازهای را در کاربرد در زمینههای ﳐتلفی از ﲨله الکﱰونیک، نور، مغناطیس و پزشکیزیستی میدهند. در یک نگاه ساده، خاصیت ویسکوالاستیکی و واکنشهای میوسﲔ، به عنوان یک گلایکو نانوپروتئﲔ، در صنایع غذایی و مباحث پزشکی از توجهی خاص برخوردار است زیرا میتواند یک نقش مهم دفاعی را در معده بازی کند. خالصسازی میوسﲔ با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی برونات - BAC - در این مقاله مورد ﲝث و بررسی قرار میگﲑد. BCA یک روش نوین و تازه در فرایندهای پایﲔ دستی برای جداسازی است که در آن تعاملات و واکنشهای غﲑویژه برونات- پروتئﲔ حذف میشود. از یوپرجیت برای اولﲔ بار به عنوان پایه جاذب در ستون کروماتوگرافی استفاده شد. آزمایشات batch binding و
اثرات pH بر روی خالصسازی میوسﲔ به طور کامل در این کار مورد بررسی قرار گرفت.
کلمات کلیدی: فنیل برونیک اسید، میوسﲔ، نانوبیو ذرات، خالصسازی، میل ترکیبی.
-1 مقدمه
در طول بیست سال گذشته، توجهی ویژه به ساخت نانومواد خودسامان از مواد آلی و بعضاً معدنی و بیومولکول ها به وجود آمده است . - 1 - میوسﲔ یک گلایکوپروتئﲔ خارج سلولی با اندازه بزرگ و وزن مولکولی 0/5 تا 20 مگا دالتون است. با این خصوصیات و وزن بالای مولکولی میتوان میوسﲔ را در نسل دوم نانوبیوذراتی چون پلاﲰید DNA، ذرات ویروس مانند، نانو ذرات پدوتئینی و ... جای داد 2 - ، . - 3 میوسﲔ اولﲔ حاملی است که مواد مغذی و داروهای ورودی باید با آن واکنش داده و به دورن آن نفوذ کنند تا جذب و به سیستم گردش خون دسﱰسی پیدا ﳕایند تا به ارگان و یا عضو مورد هدف برسند. بنابراین واکنشهای میوسﲔ بسیار مورد توجه و علاقه برای ﲠبود و توسعه دارورسانی میباشد . - 4 - بنابراین جداسازی و خالصسازی این آنزﱘ هدف اصلی در این کار مطالعاتی است.
توانایی برونات در تشکیل کمپلکس با گروههای هیدروکسیلی در کربوهیدراتها در کروماتوگرافی میل ترکیبی برونات مورد ﲠره برداری قرار گرفته است . - 5 - کروماتوگرافی میل ترکیبی برونات به مدت طولانی برای جداسازی نسل اول نانوبیوذراتی چون پروتئﲔ و آنزﱘ بکار رفته است 6 - ، . - 7 جداسازی براساس خاصیت ویژه لیگاند برونات در تشکیل کمپلکس با موادی است که دارای گروه هیدروکسیل در ساختار خود باشند . - 8 - با این حال، بیشﱰ کاربردها بر اساس خاصیت –ویژه پیوندی استوار است که در آن گلایکوپروتئﲔها میتوانند از ساختارهای غﲑ بازشناسایی شوند . - 9 - در این کار از ایزوترمهای تعادلات جذب ناپیوسته برای تعیﲔ خواص جدب میوسﲔ-آمینو فنیل برونیک اسید در شرایط ﳐتلف استفاده شدهاست. هدف اصلی در اینجا تعیﲔ میزان جذب ویژه و غﲑویژه بر روی فنیل برونیک اسید سوار شده بر پایه رزینی یوپرجیت است.
-2 مواد و روشها
1-2 مواد و ابزار
2-1 اتانادیتیول، هیدروکسید سدﱘ، کلرید سدﱘ و استیک اسید از شرکت مرک - آﳌان - خریداری شدند. -3آمینوفنیل برونیک اسید، اتیل آکریل آمید و اکسید آﳌینیوم از شرکت آلدریچ - آﳌان - و یوپرجیت از شرکت فلوکا - سوئد - ﲥیه شدند. میوسﲔ نوع III با خلوص جزیی از شرکت سیگما خریداری شد. دستگاه اندازهگﲑی pH ساخت دنور، مدل دستگاه - JASCO/FT-IR-410 - FT-IR بود. از دستگاه اسپکﱰوسکوپی مدل Jenwaye 2000 وساخت انگلیس در این کار استفاده گردید.
2-2 مراحل سنتز منومر
1/72 گرم 3آمینوفنیل برونیک اسید در 20 میلیلیﱰ 2 NaOH مولار حل کرده و در ﲪام تا دمای 2 درجه سانتیگراد میشود. قطره قطره آکریل کلراید - حدود 1/6 میلیلیﱰ - به اضافه و ﳏلول ﳘزده میشود. با اسید کلریدریک 2 مولار pH ﳏلول به 2 یا 3 رسانده شده و سپس رسوب حاصله صاف و با 50 میلیلیﱰ آب یخ شسته میشود. رسوب درحداقل آب حل و تا دمای 60 درجه سانتیگراد حرارت داده تارسوبات حل شوند. ﳏلول در ﳜچال به مدت 12 ساعت بدون حرکت قرارمیگﲑد تا کریستالها اﳚاد شوند. کریستالها خرد و با آب شسته و صاف میشوند و برای خشک شدن در دسیکاتور قرار میگﲑند.
3-2 مراحل آمادهسازی یوپرجیت و پلیمر پیوندی
11/5 گرم یوپرجیت با 100 میلیلیﱰ بافر سدﱘ فسفات - pH=8 - شسته شده و سپس رزین با 25 گرم اتانل و 25 گرم 1و2اتان ادی تیولﳐلوط شده تا واکنش دهد. این فرایند چند ساعت به طول میاﳒامد. رزین آماده چندین مرتبه با آب و الکل شستشو داده میشود تا ﲤام افزودنیها از آن خارج گردد. رزین ﳘراه با 20 میلی لیﱰ اتانل و 2/2 میلیلیﱰ دیمتیل آکریل آمید در یک بالن رﳜته شده و منومرهای فنیل برونیک اسید به آن افزوده میگردد. ﳐلوط در ﲪام آب 70 درجه سانتیگراد به مدت 6 ساعت رفلاکس میشود. از گاز نیﱰوژن برای جلوگﲑی از ورود اکسیژن استفاده شد.
4-2 کروماتوگرافی میوسﲔ و ﲣمﲔ ظرفیت پلیمر پیوندی فنیل برونیک اسید- یوپرجیت
به 6/5 میلیلیﱰ جاذب در ستونی با قطر داخلی 1 رﳜته و بعد از شستشو با بافر در 8 pH شرایط برای اﳒام آزمایش ﳏیا گردید. 0/005 گرم آنزﱘ میوسﲔ در 100 سی سی بافر بی کربنات سدﱘ 0/1 مولار حل شد. میزان جذب آنزﱘ در ابتدا خوانده شد - در 260 برابر . - 0/25 سپس آنزﱘ 50 - میلیلیﱰ و به تدریج - در ستون رﳜته و هر 1 میلیلیﱰ ﳕونهها ﲨعآوری و خوانده شد. بعد از اطمینان نسبی ازاشباع شدن ستون از بافر آماده شده - حدود 10 میلیلیﱰ و به تدریج - جهت شستشوی آنزﱘهایی که متصل نشده به لیگاند و موجوددر ستون استفاده شد. برای بدست آوردن ظرفیت ستون از ﳏلول فروکتوز 0/1 مولار در بافر گفته شد استفاده شد.
-3 ﲝث و نتیجهگﲑی
1 - 3 آنالیز FT-IR
برای اطمینان از پیوند یوپرجیت با لیگاند، ماده فوق بعد و قبل از واکنش مورد آنالیز را قرار گرفت - نتایج آورده نشده است - .
2-3 تعیﲔ مقدار بر در رزین
با استفاده از دستگاه ICP مقدار بر در هر گرم از رزین 0.89 میکروگرم تعیﲔ شد که نشان دهنده وجود گروههای فعال لیگاند متصل به پایه میباشد.
3-3 کروماتوگرافی میل ترکیبی برونات –میوسﲔ
چنانچه گفته شد، کروماتوگرافی میل ترکیبی به طور گسﱰدهای برای خالصسازی گلایکوپروتئﲔها به خاطر توانایی لیگاند برونات درپیوند با گروههای هیدروکسیل موجود در مواد بیولوژیکی بکار
برده میشود. تشکیل این کمپلکس برونات-هیدروکسی به دو عامل بستگی دارد:-1 نوع هندسی و شکل فضایی برونات و ساختار هیدروکسیل. با اﳒام این آزمایش مشخص شد که میوسﲔ به عنوان یک گلایکونانوپروتئﲔ میتواند به طور موثری توسط جاذب یوپرجیت-فنیل برونیک از ﳏلولهای آبی با 7<pH جذب گردد - شکل . - 1 میزان ظرفیت ستون ساخته شده با ﳏاسبه سطح زیر پیک قند 43 - میکروگرم در هر میلیلیﱰ از جاذب - ﳏاسبه شد.
-4 نتیجهگیری
از روش کروماتوگرافی میلترکیبی برونات میتوان برای جداسازی گلایک.نانوپروتئین ها با انتخاب شرایط مناسب استفاده نمود. یوپرجیت به عنوان پایه جاذب انتخاب و مرحله جذب در شرایط مختلف pH بررسی گردید و نشان داده شد که جاذب جدید ساخته شده در جداسازی و خالصسازی نانوبیوذراتی چون میوسین توانایی دارد.
