بخشی از مقاله
چکیده
پروتئینهای موجود در مواد غذایی، منبع غنی از پپتیدهای زیستفعال میباشند. عملکرد این پپتیدها بستگی به توالی اسیدآمینهی آنها دارد. چنین پپتیدهایی در توالی پروتئینهای پیشساز غیرفعالاند، اما هیدرولیز محدود میتواند ساختار فشردهی آنها را باز نماید و در نتیجه پپتیدهای آزاد شده میتوانند فعالیت زیستی داشته باشند - 12 - ، اساس این تکنولوژی جداسازی غشایی، روش های کروماتوگرافی تبادل یونی، اولترافیلتراسیون و نانوفیلتراسیون می باشد.تحقیقات نشان میدهند که کازئینها و پروتیینهای آبپنیر میتوانند منابع مهمی از پپتیدهای زیست فعال باشند - 11 - ، از جمله نقشهایی که این ترکیبات در بدن ایفا میکنند می توان به بهبود فعالیت سیستم ایمنی بدن، کاهش کلسترول، تنظیم فعالیت سیستم قلبی-عروقی، تنظیم فعالیت سیستم عصبی و فعالیت ضد- میکروبی اشاره نمود . - 10 - با توجه به رشد روز افزون توجه پزشکان به غذاهای عملگرا، تولید این نوع فرآوردهها در صنایعغذایی امری اجتناب ناپذیر میباشد.
.1مقدمه
روشهای معمول مورد استفاده برای رهایش و فعال شدن توالیهای پپتیدی شامل هیدرولیز آنزیمی، تخمیر میکروبی و تکنیکهای مولکولی میباشد. هیدرولیز آنزیمی پرکاربردترین روش تولید پپتیدهای زیستفعال با بازدهی بالا میباشد . - 11 - پروتئینهای شیر گستره وسیعی از فعالیت-های تغذیهای، عملکردی و زیستی را در بر گرفتهاند. بسیاری از پروتئین-های شیر خصوصیات زیستی ویژهای دارند که این اجزاء را به ترکیبات بالقوه غذاهای بهبود دهنده سلامتی بدن تبدیل میکنند. امروزه توجه به پپتیدهای زیستفعال از نظر فیزیولوژیکی، که از پروتئین های شیر مشتق شده افزایش یافته است .
- 12 - این پپتیدها در توالی ملکول پروتئین اصلی غیرفعال هستند ولی پس از آزادسازی از طریق هیدرولیز آنزیمی، توسط میکروارگانیسمها در دستگاه گوارش و یا آنزیمهای پروتئولیتیک استخراج شده از میکروارگانیسمها و گیاهان، فعال شده و به عنوان یک ترکیب با فعالیت زیستی ایفا نقش مینمایند. این توالیها معمولا بین 20-2 اسید-آمینه را شامل میشوند . - 9 - پروتئینهای منابع دیگر که دارای توالیهای خاموش فعال زیستی میباشند شامل تخم انواع پرندگان، گوشت، ماهی و همچنین انواع منابع گیاهی پروتئینی نظیر سویا میباشند . - 8 -
.2روشهای تولید پپتیدهای زیستفعال
.1,2هیدرولیز آنزیمی
معمولترین روش تولید پپتیدهای زیستفعال میباشد. بسیاری از این پپتیدها با استفاده از آنزیمهای معدهای و رودهای نظیر پپسین و تریپسین تولید میشوند. به عنوان مثال، آنزیم تبدیل کننده آنژیوتنسین، پپتیدهای بازدارنده 2ACE و فسفوپپتیدهای متصل به کلسیم - CPPs - اغلب توسط تریپسین تولید میشوند. سایر آنزیمهای گوارشی و ترکیبی از انواع آنزیم-های پروتئیناز شامل آلکالاز، کیموتریپسین، پانکراتین، پپسین و ترمولیزین و همچنین آنزیم هایی بامنشا قارچی و باکتریایی برای تولید انواع پپتید-های زیستفعال مورد استفاده قرار گرفتهاند . - 12 -
.2,2تخمیر میکروبی
بسیاری از محیطهای کشت آغازگر مورد استفاده در صنعت شیر قابلیت پروتئولتیکی بالایی دارند. پپتیدهای زیستفعال با فعالیت باکتری-های آغازگر یا غیرآغازگر مورد استفاده در تولید فرآوردههای تخمیری شیری تولید میگردند. باکتریهای خانواده اسیدلاکتیک باکتریها - LAB3 - همچون لاکتوکوکوسلاکتیس، لاکتوباسیلوسهلویتیکوس و لاکتوباسیلوسبولگاریکوس سیستم پروئینازی پیچیده و کاملی دارند. این سیستم پروتئولتیکی شامل پروتئینازهای متصل به دیواره سلولی و پپتیدازهای درون سلولی مجزا شامل اندوپپتیدازها، آمینوپپتیدازها، تری-پپتیدازها و دیپپتیدازها میباشد. از آنجایی که فعالیت آنزیمهای پروتئینی تحت شرایط رشدی تحت تأثیر قرار میگیرند این امکان را فراهم میآورد که شکلگیری پپتیدها را بتوان تا یک میزان معینی کنترل کرد.
در طی برخی مطالعات و تحقیقات مشخص گردیده که لاکتوباسیلوس هلویتیکوس که بطور وسیعی در استارترهای لبنی مورد استفاده برای تولید فرآوردههایی همچون پنیر امنتان بکار میرود قادر به تولید پپتیدهای زیستفعال بسیار مهمی میباشند، ولی همان پپتیدهای زیستفعال مذکور در فرآوردههایی مثل ماست، شیر ترش یا آبپنیر تخمیر شده شناسایی نگردیدهاند. اما جالب است که با هیدرولیز متعاقب این فرآوردهها با پپسین و تریپسین - درشرایط آزمایشگاهی - پپتیدهای زیستفعال مورد نظر تولید و در فرآوردههای مذکور شناسایی شدهاند.
این موضوع روشن میکند که خوردن فرآوردههای تخمیری همچون ماست، آزاد شدن پپتیدهای زیست-فعال مهم را در دستگاه گوارش - ناشی از هضم گوارشی - تسهیل و تسریع مینماید.مشهورترین پپتیدهای باز دارنده ACE ، val-pro-pro - VPP - و Ile-pro-pro - IPP - در شیر تخمیری توسط باکتری لاکتوباسیلوس هلوتیکوس شناسایی شده است . طی مطالعه ای توانایی شکل گیری پپتید های بازدارنده ACE از آب پنیر و کازئین درطول تخمیر با آغازگرهای مختلف لبنی تجاری که در تولید ماست و شیر تخمیری به کار می روند، بررسی شده است و هیچگونه فعالیت باز دارندگی ACE در این هیدرولیزها مشاهده نشده است.
هضم بیشتر نمونه مذکور با پپسین و تریپیسن منجر به آزاد شدن چندین پپتید بازدارنده ACEقوی که اساساً از s1 -کازئین و Bکازئین مشتق شده اند می شود. بازدارندهترین جزء شیر تخمیری اساساً شامل Bکازئین مشتق شده از پپتیدهای بازدارنده ACE، - IC50 - باغلظتی متغیر از 8 تا 11,2 میکروگرم بر میلیلیتر میباشد. تحقیقات نشان دادهاند که هیدرولیز پروتئینهای شیر توسط آنزیم-های گوارشی و یا میکروبی ممکن است پپتیدهایی با فعالیت های تعدیل کننده ایمنی بدن تولید کنند. گوارش بخشهای کازئین با پپسین و تریپسین، پپتیدهایی را تولید میکنند که اثرات تعدیل ایمنی را در خون انسان تحریک میکنند.
پپتیدهایی که از کازئین کامل و s1 کازئین مشتق شدهاند عمدتاً از تکثیر و ازدیاد لنفوسیتها در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری میکنند درحالیکه پپتیدهایی که از بتا-کازئین و کاپا-کازئین مشتق شدهاند اساساً میزان ازدیاد و تکثیر را تحریک مینمایند. اثر تعدیل ایمنی شیر تخمیری به پپتیدهای آزاد شده از اجزای کازئین نسبت داده میشود. این نتایج بیان میکنند که LAB ممکن است خصوصیات ایمنی
پروتئینهای شیر را قبل و بعد از گوارش دهانی محصول تعدیل نمایند، چنین تعدیلی ممکن است مفید و سودمند باشد؛ مثلاً سبب کاهش واکنش های حساسیت شدید4 نسبت به هضم پروتئینها در بیماران دارای حساسیت به غذای پروتئینی گردد.
علاوه بر میکروارگانیسمهای زنده، آنزیمهای پروتئولیتیک ایزوله شده از LAB برای جداسازی پپتیدهای زیستفعال پروتئینهای شیر به کار گرفته میشوند . اغلب پپتیدهای بازدارنده ACEمعمولاً پپتیدهایی کوتاه با یک پرولین باقی مانده در انتهای کربوکسیلی خود میباشند. پرولین در برابر آنزیم های گوارشی مقاوم بوده و ممکن است از روده کوچک عبور کرده و به جریان خون برسد و در توالی پپتیدهای کوتاه قرار گیرد - 10و. - 12
.3,2روش مولکولی
در سالهای اخیر پپتیدهای مختلف کوچکی از هیدرولیز پروتئولیتیک پروتئینهای غذایی ایزوله شدهاند که فعالیتهای فیزیولوژیکی مختلفی همچون تنظیم سیستم عصبی، فعالسازی مکانیسم ایمنی سلول و بهبود عمکرد سیستم قلبی عروقی را نشان دادهاند.تا به امروز E.coli اصلاح شده به طور گسترده به عنوان یک میزبان سلولی برای بیان پروتئین خارجی به دلیل ژنتیک شناخته شده، انتقال موثر، سرعت رشد بالا در محیط کشت ساده، ظرفیت تخمیر مداوم و هزینهی نسبتا کم استفاده میشود. E.coli قادر به انجام تغییرات بعد از رونویسی همچون تاشدگی سریع که در ساختار دوم، سوم و چهارم جهت خواص عملکردی پروتئین مورد نظر نیاز است، میباشد. این تغییرات می توانند فعالیت زیستی، عملکرد، ساختار، ثبات، نیمهعمر، مقاومت پروتئازی و بخش بخش شدن پروتئین را تحت تاثیر قرار دهند.استفاده از مهندسی ژنتیک در مقایسه با روشهای مصنوعی دیگر برای رسیدن به پروتئین یا پپتید به دلیل صرفهجویی در زمان و مرقوم به صرفه بودن ترجیح داده میشود - 3و. - 4
.3× اثرات مفید پپتیدهایزیستفعال
پپتیدهای زیستفعال در توالی پروتئینهای پیشساز غیرفعالاند اما هیدرولیز محدود میتواند ساختار فشردهی پروتئینها را باز نماید و در نتیجه پپتیدهای آزاد شده میتوانند فعالیت زیستی مفید متعددی داشته باشند. پروتئینهای شیر یک منبع سرشار از پپتیدها را فراهم می آورند که در مدت گوارش معدهای، رودهای یا تخمیر شیر فعال میشوند، این پپتید-ها تعدیل کنندههای بالقوه بسیاری از روندهای تنظیمی در سیستمهای زنده میباشند - . - 6
.3,1 تنظیم سیستم قلب و عروق5
آنزیم بازدارنده ACE در ارتباط با سیستم رنین-آنژیوتنسین که تنظیم کننده فشار خون است میباشد و میتواند اثر ضد فشارخون داشته باشد. میزان زیادی از پپتیدهای بازدارنده ACE میتوانند به وسیله گوارش آنزیمی پروتئینهای شیرهای مختلف ایزوله شوند. برای نشان دادن اثر ضد فشار خون پس از مصرف دهانی ، می بایست پپتیدهای فعال به شکل سالم و دستنخورده از روده جذب شوند و بعلاوه نسبت به پپتیدازهای پلاسما مقاوم بوده و از طرف دیگر به جایگاه هدف خود برسند.
در واقع این مسئله به وسیله کشت سلول های تک لایه CaCo2 که مشابه سلول های روده انسان هستند نشان داده شده است. بدین صورت که تریپپتید VPP بازدارنده ACE را می توان از طریق مسیرهای خاص و میان سلولی در سراسر لایه سلول انتقال داد. اگرچه مقدار قابل توجهی پپتید به وسیله پپتیدازهای میان سلولی به آمینواسید تبدیل میشود. همچنین مشخص شدهاست که پرولینهای دارای پپتید عموماً نسبت به هضم توسط آنزیم-های گوارشی مقاومت میکنند - . - 12
.3,2فعالیت کاهش فشار خون6
فشار خون بالا یکی از عوامل مسبب در بیماریهای قلبی-عروقی می-باشد - . - 2 در سالهای اخیر پروتئینهای غذایی به عنوان پپتیدهای بازدارنده ACE مشخص شدهاند که از جمله منابع اصلی این پپتیدها می-توان محصولات لبنی، گوشت، تخممرغ، سویا و... را بیان کرد، این پپتیدهای مغزی در پیشگیری و درمان فشار خون موثر میباشند. پپتیدهای بازدارنده ACE قوی موجود در کازئینها و پروتئینهای آبپنیر در کازوکیننها و لاکتوکیننها موجود میباشند - . - 9 آنزیم بازدارنده ACE با سیستمهایی چون رنین- آنژیوتنسین که فشارخون خارجی راتنظیم میکنند مرتبط است. علاوه بر بازدارنده ACE پپتیدهای زیستفعال می-توانند اثرات ضد فشار خونی را از طریق مکانیسمهایی مانند جلوگیری از رها شدن اندوتلین-1 توسط سلولهای اندوتلیال، تحریک فعالیت برادیکینین، تشدید تولید نیتریک اکساید با منشا اندوتلیوم و تشدید عمل اتساع عروق متصل به گیرندههای اوپیوئید ایفا کنند - 4 و8 و. - 9
.3,3 تنظیم سیستم عصبی7
بنا به تحقیات اخیر پپتیدهایی در سیستمهای عصبی به نام پپتیدهای اوپیوئید8 شناخته شدهاند که میتوانند فعالیت تهاجمی و یا غیرتهاجمی داشته باشند - . - 2این پپتیدها از انواع مشتقهای کازئین هیدرولیز شده توسط آنزیمهای گوارشی حاصل میشوند.
