بخشی از مقاله
چکیده:
پنی سیلین یک متابولیت ثانویه است که از کپکهای پنی سیلیوم کرایسوژنوم و نوتاتوم تولید می شود.کشف پنی سیلین و کاربرد آن در پزشکی بدون شک یکی از بحث انگیز ترین دستاوردهای قرن بیست و یکم می باشد. با نگاهی بر رشد تصادفی در محیط کشت تا بکارگیری علم و تکنولوژی در تولید آن مشخص می گردد که تولید پنی سیلین از آغاز کشف تاکنون دستخوش تغییرات زیادی گردیده است.
پنی سیلین پرکاربردترین آنتی بیوتیک برای درمان عفونتهای باکتریایی در سطح گسترده می باشد. تولید صنعتی این آنتی بیوتیک بوسیله تخمیر به مدت پنجاه سال از مثالهای بارز کاربرد بیوتکنولوژی میباشد. در این مقاله آنتی بیوتیکهای مورد استفاده قبل از کشف پنیسیلین، تاریچه کشف و صنعتی سازی پنی سیلین، اجزای تشکیل دهنده محیط کشت جهت تولید صنعتی، تولید کالچرهای محافظت شده، نحوه افزایش در حجم تخمیر و پایش آن، شرایط و الزامات کپک در حین تخمیر و خالص سازی آن مورد بحث قرار گرفته است.
استخراج پنی سیلین مراحل مختلفی دارد که شامل مراحل -1 بالادستی -2 تخمیر -3 پایین دستی، می باشد. در مرحله بالادستی، باید اسپور کپک پنی سیلیوم کرایسوژنوم تولید و خالص سازی شود. اسپور های کپک پنیسیلیوم باید تولید و نگهداری شده و در صورت نیاز آنها را فعال نموده تا به فرم رویشی تبدیل شوند. برای تولید توده سلولی باید از محیط کشت کوچک با حجم پایین شروع و به فرمانتورهای پایلوت با حجم بالا انتقال یابد تا افزایش میزان سلولی آغاز و نحوه افزایش حجم پایش گردد. تولید پنی سیلین باید در مرحله اصلی یعنی مرحله تخمیر صورت پذیرد. مرحله پایین دستی شامل فیلتراسیون براث، خنک کردن، استخراج پنی سیلین بوسیله حلال، تصفیه با کربن فعال، تولید نمک پنیسیلین، کریستالیزاسیون، شستشوی کریستالها و در نهایت خشک کردن کریستالها می باشد.
مقدمه:
پنی سیلین اولین آنتی بیوتیک طبیعی بود که کشف گردید. قبل از آن پرونتوزیل - Prontosil - اولین ترکیب شیمیایی بود که توسط محققین آلمانی در سال 1933 کشف گردید که برای برخی بیماری های عفونی تجویز می شد. این ترکیب از دسته سولفونامیدها بوده که بر روی برخی باکتریها ازقبیل استرپتوکوکها موثر بود. این ترکیب به دلیل عوارض جانبی گستردهای خصوصا بر روی کلیه ها داشت دیگر مورد استفاده قرار نگرفت.
شکل :1 داروی پرونتوزیل و ساختار آن
پنی سیلین متابولیت تولید شده از کپک پنی سیلیوم کرایسوژنوم می باشد که بدلیل کاربرد پزشکی آن به تولید انبوه رسیده است. در سال 1928 الکساندر فلمینگ در حال تحقیق بر روی آنفولانزا بود. بررسی وی برروی عامل ضد میکروبی متمرکز بود. در زمان جنگ او سربازان بیشماری را میدید که نه به خاطر جراحاتی که بر آنها وارد می شد بلکه به دلیل عفونتهای ثانویهای که دچار میشدند از بین میرفتند. هنگامی که وی در آزمایشگاه نبود پلیتی که در آن استافیلوکوکوس اورئوس کشت داده شده بود به کپک آبی- سبز رنگی آلوده شده و در محل بروز این آلودگی هاله عدم رشد ایجاد شده بود. بدین ترتیب بود که وی دریافت کپک ماده آنتی بیوتیک را تولید نموده است.
همچنین به دلیل اینکه آنتی بیوتیک تولید شده از کپکهای پنی سیلیوم نوتاتوم تولید شده بودند نام پنی سیلین را بر روی این متابولیت انتخاب کرد. وی در سال 1929 نتایج بررسی خود را با محوریت اینکه این ماده دارای پتانسیل درمانی است، منتشر نمود. در سال 1938 دکتر هاوارد فلوری مقاله دکتر فلمینگ را بررسی کرده و همراه با دکتر ارنست چین همکاری خود را با دکتر فلمینگ در آزمایشگاه دانشگاه آکسفورد به منظور تولید و استخراج و خالص سازی پنیسیلین آغاز میکنند.
در آغاز با استفاده از تجهیزات صنایع شیر مقداری پنی سیلین به منظور آزمایش های اولیه تولید گردید. سپس پنی سیلین استحصالی برروی موشها آزمایش شد که اثرگذاری آن اثبات گردید. در مورد آزمایش روی انسان گروه دکتر فلوری بدلیل کم بودن میزان پنیسیلین بدست آمده به موفقیت دست پیدا نکردند و فرد مورد معالجه به دلیل کم بودن میزان پنیسیلین تولید شده زنده نماند. به هر حال در سال 1941 کاملا مشخص شده بود که پنی سیلین داروی ارزشمندی است که میتواند جان هزاران نفر را نجات دهد. دکتر فلوری در همان سال به ایالت متحده رفت چراکه این کشور در جنگ اعلام بیطرفی کرده بود.
بدلیل اینکه این کشور قصد داشت وارد جنگ جهانی دوم شود پروژه پنی سیلین به عنوان یک پروژه جنگی اعلام شد و بودجه هنگفتی به آن اختصاص یافت و در اولویت پژوهش قرارگرفت. با این حال گروه دکتر فلوری توانست با استفاده از تجهیزات صنعت آبجوسازی مقادیر زیادی از مایع حاوی کپک تولید کننده پنیسیلین را تولید نمایند . بدین ترتیب پنیسیلین قابل استفاده در پزشکی تولید گردید و در دسترس نیروهای نظامی در نیمه اول دهه 40 میلادی قرار گرفت.
تعاریف
در این قسمت برخی تعاریف در خصوص تفاوتهای متابولیسم اولیه و ثانویه بیان می گردد. متابولیسم اولیه متابولیسمی است که به منظور تولید انرژی برای سلول و بیوسنتز آن انجام می گیرد. در ارگانیسم های هوازی مانند پنی سیلیوم کرایسوژنوم متابولیسم اولیه شامل تبدیل قندهایی مانند گلوکز به اسید پیروویک و تولید انرژی از طریق چرخه کربس میباشد. متابولیسم ثانویه مربوط به تولید متابولیتهایی میشود که در تولید انرژی سهمی ندارند مانند پنیسیلین تولید شده توسط پنیسیلیوم کرایسوژنوم. این متابولیت ها به عنوان مکانیسم دفاعی علیه میکروارگانیسمهای موجود در محیط استفاده میگردد.
به عبارت دیگر پنیسیلیوم کرایسوژنوم می تواند در رقابت با میکروارگانیسمهای محیط پیروز شده و به طور موثری گسترش یابد. باید توجه داشت که اینگونه متابولیتهای ثانویه توسط میکروارگانسیم و فقط در زمانهای استرس و هنگاهی که منابع غذایی کاهش یابند به مقدار زیادی تولید شده تا رقبای موجود در محیط زیست خود را از بین برده و خود زنده بماند. از این مکانیسم یاد شده در صنعت به منظور حداکثر تولید محصول در فرمانتور استفاده میشود.
ساختار و مکانیسمهای ممانعت کنندگی
همانطور که در شکل مشخص شده پنی سیلین یک ترکیب ساده نمیباشد بلکه مجموعه ای از ترکیبات به هم مرتبط میباشد که همه آنها از یک ساختار حلقوی به نام بتا لاکتام تشکیل شده اند. پنی سیلین تریپپتیدی است که از سه اسید آمینه ال والین - ال سیستئین و ال آلفا آمینوآدیپیک اسید تشکیل شده است. اسید آمینه های والین و سیستئین در ترکیب با هم حلقه بتا لاکتام را تشکیل میدهند.
ساختار پنیسیلین و اسید آمینه های تشکیل دهنده آن
سومین آمینواسید این تری پپتید بوسیله یک گروه آسیل جای گزین شده و ماهیت گروه آسیل باعث بوجود آمدن گونههای مختلفی از پنی سیلین می شود. سه ساختار در پنی سیلین قابل مشاهده است
-1 حلقه بتالاکتام
-2 تیازولیدین
-3 گروه آسیل. اتصال حلقه بتالاکتام و تیازولیدین ساختار پنام را ایجاد میکند.
دو گروه از پنی سیلین وجود دارد: پنی سیلین بیوسنتز شده که طبیعی بوده و از کپک طی فرآیند تخمیر بدست می آید. فرم دیگر نیمه سنتزی می باشد که همگی از مشتقات نیمه سنتزی پنی سیلین می باشد مانند: آمپی سیلین، پنی سیلین V، اگزاسیلین و... این ترکیبات دارای ساختار پایه ای پنی سیلین بوده اما توسط فرآیند های شیمیایی گروه آسیل آن جدا شده و ترکیب 6 آمینو پنی سیلانیک اسید ایجاد میشود.
در ادامه با اضافه شدن گروه های آسیلی مختلف به آن، پنی سیلین با خصوصیت جدید ایجاد می شود. از جمله این خصوصیات مقاومت به اسیدهای معده می باشد که در ابنصورت می توان آنها را به صورت خوراکی مصرف نمود. از دیگر خصوصیات آنها میتوان به مقاوم بودن در برابر سایر باکتریهایی که دارای آنزیم پنی سیلیناز هستند نام برد. پنی سیلین G یا بنزیل پنی سیلین بیشترین مورد استفاده را داردکه بصورت تزریقی استفاده میشود. اگر این نوع پنیسیلین به صورت خوراکی مصرف گردد توسط محیط اسیدی معده نابود شده و به جریان خون منتقل نخواهد شد.
سلول های باکتری دارای آنزیمی هستند به نام ترانس پپتیداز. این آنزیم باعث اتصال زنجیره های پپتیدوگلیکان دیواره سلول می گردد که در نتیجه دیواره سلولی باکتری شکل گرفته و سلول باکتری ساختار مستحکمی به خود می گیرد. حلقه بتالاکتام موجود در پنی سیلین به جایگاه فعال آنزیم ترانس پپتیداز متصل شده و با این امر مانع از فعالیت آنزیم شده و در نتیجه دیواره باکتری شکل نگرفته و تضعیف میشود. در این صورت باکتری در مقابل نفوذ آب و مواد خارج سلولی مقاومت نکرده و سلول متلاشی میگردد.
شکل :3 مکانیسم اثر پنیسیلین برروی آنزیم ترانس پپتیداز
مراحل پایین دستی
الزامات محیط کشت
در خصوص انجام هرگونه فرآیند تخمیری، تعیین محیط کشت مهمترین مرحله انجام کار می باشد . هدف محیط کشت فراهم آوردن تمامی عناصری است که برای سنتز مواد سلولی و شکلگیری محصولات مورد نیاز می باشد. از طرف دیگر محیط کشت باید محیط مناسبی برای رشد میکروارگانیسم فراهم آورده و نسبت به هزینه آن کارایی بالایی داشته باشد. تمام میکروارگانیسم ها به منظور رشد و پایداری سلول نیازمند کربن، هیدروژن، گوگرد و نیتروژن هستند.
در اکثر موارد میکروارگانیسمها مقادیر کمی از عناصر کم مقدار از قبیل مس، منگنز و کبالت که از طریق آب تامین میشوند را نیز استفاده میکنند. فاکتورهای رشد مانند ویتامینها و اسیدهای آمینه هم نیاز خواهد بود. برخی از میکروارگانیسمهای مشخص مانند پنیسیلیوم کرایسوژنوم که آنتیبیوتیک یا سایر متابولیت های ثانویه را تولید می کنند نیازمند پیش سازهایی مانند بازهای پورین و پریمیدین و فنیل استیک اسید برای تولید پنیسیلین G یا فنوکسی استیک اسید برای تولید پنیسیلین V میباشند. برای تامین منبع کربن از نشاسته استفاده می شود که میکروارگانیسم میتواند از گلوکز موجود در آن استفاده نماید.
