بخشی از مقاله
چکیده
کپک خاکستری ناشی از بوتریتیس سینیرا یکی از عوامل اصلی آلودگی میوه جات میباشد. این کپک بیش از 200 گونه گیاهی را آلوده میکند و به دلیل روشهای مختلف حمله آن، میزبانهای متنوع و زنده مانی میسیل یا کنیدی؛ کنترل این قارچ مشکل است. پروبیوتیکها میکروارگانیسمهای مفیدی هستند که به دلیل خواص ایمنی زایی که دارند سبب بهبود سلامت انسان و حیوان میشوند. بیشتر تحقیقات انجام شده در خصوص این میکروارگانیسمها در مورد نقش آنها در ممانعت کنندگی سایر باکتریها است ولی نتایج جدید نشان داده که میتوانند از رشد قارچ هم جلوگیری و حتی برخی با مایکوتوکسینها مداخله کنند. در این تحقیق تاثیر ممانعت کنندگی پروبیوتیکهای مختلف - خود پروبیوتیکها و متابولیت-های آنها - بر روی رشد کپک بوتریتیس سینیرای جداسازی شده از توت فرنگیهای آلوده مورد مطالعه قرار گرفت. بیشترین میزان ممانعت کنندگی برای متابولیتهای ناشی از رشد پروبیوتیک L. Casei در محیط MRS براث و در غلظت 30 درصد بود ولی کمترین برای متابولیتهای ناشی از رشد S. boulardii در محیط YNB مشاهده شد. در خصوص رشد همزمان پروبیوتیک به همراه کپک مشاهده شد که بالاترین میزان ممانعت کنندگی برای L. Fermentum و کمترین هم برای S. boulardii بود. نتایج نشان داد که حضور همزمان پروبیوتیکها در محیط کشت کپک به دلیل خواص رقابتی و یا استفاده از متابولیتهای ناشی از رشد پروبیوتیک میتواند در کند کردن رشد کپک خاکستری موثر باشد.
مقدمه
کاهش ضایعات پس از برداشت محصولات تازه کشاورزی به دلیل افزایش امنیت غذایی و جلوگیری از هدر رفتن سرمایه، یکی از چالشهای مهم پیش روی جوامع میباشد. سالیانه میزان بالایی از میوه و سبزیجات تازه تولید شد به دلایل مختلف به شکل ضایعات از بین میروند که این امر به نوبه خود باعث کاهش دسترسی اقشار مختلف به مواد غذایی به ویژه میوهها و افزایش هزینههای تولید میگردد. استفاده از مواد شیمیایی مختلف یکی از روشهای موثر در کاهش ضایعات میباشد که این هم به نوبه خود برای سلامت انسان و محیط زیست مضر بوده و امروزه رویکردهای جدیدی در مورد استفاده از موادی که اثرات سوء و زیان آوری در انسان و محیط به همراه نداشته باشند حائز اهمیت میباشد - فرهی و حقانی فرد، . - 1396
از میان بیماریهای مهم پس از برداشت توت فرنگی، پوسیدگی خاکستری بسیار حائز اهمیت بوده و بیشتر مورد بررسی قرار گرفته است. علایم این بیماری به این صورت است که بافتهای آلوده به رنگ صورتی تیره تا قهوهای در آمده و تمام میوه ممکن است بدون از هم پاشیدگی به طور کامل پوسیده شود. بر روی بافت آلوده میوه میسیلیومهای سفیدی نمایان میشود که در زمان اسپوردهی به رنگ خاکستری در میآید - مستوفی و مرجانلو، . - 1389 پوسیدگی خاکستری - Botrytis cinerea - از نظر اهمیت اقتصادی به ویژه در سالهای پر باران، مهم ترین بیماری توت فرنگی به شمار میاید. طبقه بندی جنس بوتریتیس به طور کلی بر پایه خصوصیات ریخت شناختی یا مورفولوژیک، رشد روی محیط کشت و اختصاصی بودن میزبان میباشد. مهمترین گونه این جنس B. cinerea است که روی دامنه گستردهای از گیاهان میزبان به صورت انگل یا ساپروفیت رشد میکند ولی بیشتر گونههای دیگر آن دامنه میزبانی محدودتری دارند. یاختههای ریسهای و کنیدیومی بوتریتیس چندهستهای هستند. در کنیدیومها تعداد هسته بین 3 تا 6 عدد است - طالشی و همکاران، . - 1395
پروبیوتیکها به ریز اندامگان زندهای اطلاق میشوند که در صورت استفاده به مقدار کافی، میتوانند نتایج مثبتی را بر سلامت شخص مصرف کننده داشته باشند. برخی از خواص عملکردی مطلوب نسبت داده شده به این ریز اندامگان شامل؛ محافظت در برابر باکتریهای بیماری زا - از طریق رقابت و یا ممانعت کنندگی رشد آنها، ترشح ترکیبات ضد میکروبی، کاهش pH، خنثی سازی و حذف سمها از روده - ، تحریک تولید موکوس و همچنین افزایش تکثیر سلولهای مخاط گوارشی میباشد. به علاوه گزارش شده که پروبیوتیکها خاصیت ایمنی زایی دارند، کاهش عوارض اسهال، جلوگیری از التهاب روده، کاهش سطح کلسترول خون، جلوگیری از آلرژی و کنترل عفونتهای ادراری تناسلی از خواص درمانی دیگر بر شمرده برای این ریز اندامگانها میباشد . - Freitas, 2014 - امروزه مصرف مواد غذایی همراه با پروبیوتیکها به دلیل افزایش تمایل مصرف کنندگان به داشتن تغذیه سالم و ایمن رو به افزایش است. متداولترین باکتریهای تجاری که به عنوان پروبیوتیک استفاده میشوند، شامل لاکتوباسیلها و بیفیدیوها هستند . - Rastall et al., 2000 -
برای اینکه پروبیوتیکها نقش خود را در سلامت انسان ایفاء کنند، ضروری است که هم زنده مانی و هم فعالیت متابولیکی آنها در طی فرایند غذایی، چرخه رسیدن محصول به دست مشتری و همچنین در درون مسیر گوارشی حفظ گردد - Nguyen et . - al., 2016 تحقیقات نشان داده که استفاده از باکتریهای اسید لاکتیک نه تنها خواص سلامت بخشی به ماده غذایی می-بخشد، بلکه میتواند نقش محافظت کنندگی را در مقابل عوامل بیماری زا در نگهداری طی زمان محصولات مختلف و آن هم به دلیل رقابت با عوامل بیماری زا برای مواد مغذی - ویتامینها، مواد معدنی، مواد جزئی و پپتیدها - و همچنین تولید اسیدهای آلی و باکتریوسیونها - پپتیدهای ضدمیکروبی - داشته باشند. بنابراین، استفاده از محیطهای پروبیوتیکی به دلیل خواص ممانعت کنندگی میتواند زمان نگهداری و ایمنی سبزیجات، میوهجات و همچنین محصولات آنها را افزایش داده که با کاهش استفاده از افزودنیهای شیمیایی همراه است . - Alegra et al., 2011 -
Wang و همکاران 2011 - و - 2012a گزارش دادند که استفاده از L. plantarum جداسازی شده از کومیس طیف گسترده-ای از ترکیبات ضد قارچی تولید مینماید که بر روی قارچهای Botrytis cinera، Alternaria solani، Phytotophthora drechsler Tucker، Fusarium oxysporum و Glomerella cingulateتاثیر ممانعت کنندگی رشد دارد. Wang و همکاران همچنین در تحقیقی دیگر در سال 2012b گزارش دادند که B. coagulans جداسازی شده از پودر شیر پس چرخ خواص ضد قارچی گستردهای بر علیه عوامل بیماری زا از قبیل B. cinera، A. solani، P. drechsler Tucker، F. oxysporum و G. cingulate نشان داد. این محققین خواص ضد قارچی این پروبیوتیکها را به تولید ترکیبات پروتئینی و سایر ترکیبات نسبت دادند و استفاده از B. coagulans بر روی گوجه فرنگیهای گلخانهای برای کنترل قارچهای پاتوژن گیاهی نتایج مطلوبی را ارائه داد. زمانی زاده و همکاران - 2013 - گزارش دادند که استفاده از Lactobacillus plantarum A7 به همراه اسانسهای زنیان و دارچین رشد بوتریتیس سینرا را بر روی توت فرنگیها - تا 90 درصد رشد میسلیوم - محدود مینماید.
از آنجایی که تحقیقات متعدد روی پروبیوتیکها اثبات نمودهاند که این ریز اندامگان به دلیل خواص رقابتی که با سایر عوامل بیماری زا دارند و همچنین تولید ترکیبات ضد میکروبی آنها رشد ریز اندامگان مضر را در محصولات غذایی مختلف محدود میسازد. بنابراین، اهداف اصلی از این تحقیق بررسی تاثیر خاصیت ممانعت کنندگی برخی از سویههای پروبیوتیک بر کاهش رشد کپک خاکستری بوتریتیس سینیرا بود.
مواد و روشها
سویهها و شرایط محیط کشت
کپک بوتریتیس سینیرا از توت فرنگیهای آلوده جداسازی و به پلیتهای حاوی محیط کشت PDA - Potato Dextrose Agar - انتقال داده شد و سپس به مدت 5 روز و در دمای 28 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. سویههای اسید لاکتیکی مورد استفاده از پنیر بومی جداسازی و شناسایی شده و به صورت لیوفیلیزه نگهداری شدند. برای احیای سلولها ابتدا مقداری از سویهها به داخل 10 میلی لیتر از محیط MRS broth انتقال و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شدند. سپس یک میلی لیتر از رقت 10-1 به داخل محیط MRS Agar منتقل و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شدند تا کلونیهای مشخصی بدهند. از کلونیها مقداری برداشته شده و در داخل 10 میلی لیتر MRS broth به خوبی حل و سپس یک میلی لیتر از آن به داخل MRS broth انتقال و در دمای 37 درجه سانتی گراد و به مدت 24 ساعت هم زده شد تا محیط کدر گردد. در نهایت در داخل لوله فالکونهای استریل منتقل و در دور 9000 g و دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. فاز بالایی به عنوان متابولیتهای مربوطه جداسازی و فاز رسوبی که حاوی سلولهای پروبیوتیک بود توسط آب مقطر استریل شسته شده و در دمای یخچال برای آزمایشات بعدی نگهداری شدند. برای ساکارومایسز بولاردی روش کار مطابق بالا بود با این تفاوت که از محیط کشت YNB - Yeast extract nitrogen base - broth و YMA - Yeast extract malt agar - استفاده گردید. جدول .1 سویه- های پروبیوتیکی به کار برده شده به همراه کد آنها را نشان میدهد.
