بخشی از مقاله
چکیده:
در سالهاي اخیر میزان شیوع سویه هاي استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین - MRSA - در بیشتر بخش هاي دنیا در حال افزایش است.سویه هاي MRSA باکتري هایی هستند که نسبت به آنتی بیوتیک هاي خاصی مقاومند. مقاومت به متی سیلین با بیان ژن mecA که باعث تولید پروتئین2 متصل شونده به پنی سیلین - PBP2 - می شود در در استافیلوکوکوس ها ایجاد می شود. بروز ناگهانی سویه هاي MRSA درمان آن ها را با مشکلات زیادي همراه کرده است و ونکومایسین بعنوان آخرین داروي انتخابی در درمان بکار میرود.
در این بررسی تست آنتی بیوگرام تعداد 100 سویه استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین که توسط آزمایش هاي متداول میکروب شناسی تایید شده بودند با روش دیسک دیفیوژن و بروش کربی باوئر و بر اساس دستورالعمل CLSI ونیز میزان حداقل غلظت ممانعت کنندگی از رشد - MIC - براي آنتی بیوتیک هاي اگزاسیلین و ونکومایسین تعیین گردید، و پرایمرهاي اختصاصی ژن هاي mecA وvanA و vanB در آن ها طراحی و وجود این ژن ها در آن ها بروش PCR ارزیابی شد. نتایج نشان داد که درصد مقاومت ایزوله ها بروش دیسک دیقیوژن بصورت زیر بود: متی سیلین %67، ونکومایسین %0، پنی سیلین %100، اریترومایسین %42، سیپروفلوکساسین %68، جنتامایسین %100، کلیندامایسین %65 ، تعیین میزان MIC بروش ADM نشان داد که %67 ایزوله ها مقاوم به نتی سیلین و %4 ایزوله ها ذاراي مقاومت متوسط به ونکومایسین - ≤8µg/ml - بودند.
میزان مقاومت به متی سیلین بر اساس وجود ژن mecA در ایزوله ها%67 و vanA صفر درصد بود . این مطالعه نشان داد که سویه هاي کلینیکی داراي مقاومت بالایی نسبت به متی سیلین، اریترومایسین، جنتامایسین، پنی سیلین و کلیندامایسن بوده و هیچ مقاومتی به ونکومایسین مشاهده نشد و براي جلوگیري از شیوع سویه هاي VRSA بایستی داروي ونکومایسین با دقت در درمان سویه هاي استافیلوککی مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه:
استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان یک عامل بیماریزاي قدرتمند، که عفونت هاي متعددي را ایجاد می کند شناخته شده است. استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین - Methicillin- resistant Staphylococcus aureus - MRSA یکی از عوامل اصلی عفونت هاي بیمارستانی و اکتسابی از جامعه است که امروزه مقاومت چندگانه اي را نسبت به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها، از جمله بتالاکتام ها، آمینوگلیکوزیدها، جنتامایسین ها، تتراسیکلین ها، فلوروکوئینولون ها و ماکرولیدها کسب کرده است.
بنابراین امروزه تعداد محدودي از آنتی بیوتیک ها بعنوان دارهاي ضد استافیلوکوکی همچون ونکومایسین و تیکوپلانین در دسترس هستند. مقاومت به متی سیلین در استافیلوکوك ها بدلیل تولید بیش از حد PBP2a است که یک پروتئین متصل شونده به پنی سیلین تغییر یافته است و تمایل کمی براي اتصال به آنتی بیوتیک هاي خانواده بتالاکتام نشان می دهد - . - 1- 3 در این بررسی سعی شد تا میزان مقاومت به ونکومایسین را در 100 ایزوله استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین را که از نمونه هاي بالینی جدا شده از مراکز درمانی و آزمایشگاههاي تشخیص طبی استان ایلام را با روش هاي روتین آزمایشگاهی و مولکولی مورد ارزیابی قرار دهیم - . - 4
مواد و روش ها : نمونه گیري: در این بررسی تعداد 100 نمونه استاقیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین را که از نمونه هاي بالینی جدا شده از مراکز درمانی و آزمایشگاههاي تشخیص طبی استان ایلام جدا شده بودند به آزمایشگاه میکروبیولوژي دانشگاه ایلام منتقل شده و مجددا بوسیله تستهاي میکروب شناسی از جمله کاتالاز، اکسیداز، کواگولاز، تحمل نمک و تخمیر مانیتول، DNase مقاوم به حرارت تائید شدند - . - 5
بررسی حساسیت ضدمیکروبی نمونه ها: این تست در محیط مولر هینتون آگار و با استفاده از روس دیسک دیفیوژن، پنی سیلین - 10u - ، اگزاسیلین - 1µg - ، سیپروفلوکساسین - 5µg - ، ونکومایسین - - 30µg، جنتامایسین - - 10 µg،و کلیندامایسین - 30 µg - براساس معیارهاي ١NCCLS استفاده گردید. سپس MIC نمونه ها براي آنتی بیوتیک هاي اگزاسیلین و ونکومایسین به روش ADM تعیین و از سویه S.aureus ATCC29213 بعنوان سویه کنترل استفاده گردید - 7و. - 6
استخراج : DNA استخراج DNA با استفاده از کیت یکتا تجهیز آزما - - Lot:BDC20114113 ,Cat:YT9001 بر اساس دستوالعمل شرکت سازنده کیت صورت گرفت. روش PCR براي بررسی وجود ژنهاي mecA ،: vanA براي انجام روش مولکولی PCR و وجود ژن هاي mecA ،vanA و vanB سه پرایمر طراحی گردید، که سکانس نوکلئوتیدي این پرایمرها بصورت زیر بود - : - 8 دراین بررسی از سویه S.aureusATCC25923 بعنوان سویه کنترل منفی و از سویه S.aureus MRSA 400 بعنوان کنترل مثبت استفاده گردید.
سویه هاي استاندارد از مرکز پژوهش هاي علمی صنعتی ایران بخش کلکسیون میکروبی تهیه گردیدند. براي انجام PCR مخلوط نهایی واکمش با حجم 25 میکرولیتر شامل 0/1 میلی مول از هر آغازگر - - Primer ، 2/5 میکرولیتربافر PCR 1X ، میزان 1/5 میلی مول MgCl2 ، 0/2 میلی مول dNTPs ، 2 میکرولیتر DNA الگو، 1/5 واحد آنزیم - Cinna Gen - Taq DNA polymerase بود که حجم نهایی با آب دیونیزه استریل به 25 میکرولیتر رسانده شد.
برنامه دستگاه ترموسایکلر - Master cycler gradient,Ependrof Germany - نیز به اینصورت تنظیم شد که : واسرشتگی اولیه - Initial denaturation - در 95 درجه سانتی گراد براي 5 دقیقه و بعد از آن 35 چرخه شامل واسرشتگی در 95 درجه سانتی گرادبراي 2 دقیقه، اتصال در58 درجه سانتی گراد براي 1 دقیقه، تکثیر در 72 درجه سانتی گراد براي 1 دقیقه و تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی گراد براي 10 دقیقه - البته برخی دماها براي سه پرایمر متفاوت بود - .
ژل الکتروفورز: محصولات PCR توسط الکتروفورز، با استفاده از ژل 1/5 درصد آگارز]وزن یه حجم [ - W/V - حاوي 0/5 میکرولیتر در میلی لیتر اتیدیوم بروماید، از یکدیگر جدا شدند و سپس در زیر نور ماوراء بنفش - UV - در طول موج 260 نانومتر توسط دستگاه Transilluminator مشاهده شدند. براي تعیین اندازه محصولات از یک نشانگرمولکولی - DNA 100 ladder - جفت بازي - Gene RulerTM, Fermentaz - استفاده شد - . - 9
آنالیز آماري: تجزیه و تحلیل داده ها و نتایج با استفاده از نرم افزار آماري SPSS - نسخه 11/5 برنامه ویندوز - و نرم افزار - Microsoft Office - Excel 2007 و آزمون آماري χ 2 انجام گرفت و P-value < 0.05 از نظر آماري با اهمیت و معنی دار در نظر گرفته شد.
