بخشی از مقاله
چکیده:
زیست توده اجزای قابل تجزیه زیستی از محصولات، پسماندها و زائدات کشاورزی، صنعتی و شهری قابل تجزیه است که توسط میگروارگانیسم ها به راحتی تجزیه می گردد. در نتیجه سوبسترای ارزان قیمتی برای رشد میکروارگانیسم ها و تولید آنزیم های مفید وهمچنین تولید سوخت های زیستی ارزان قیمت می باشد.
مواد و روش ها: در این آزمایش با استفاده از روش طراحی آزمایش فاکتوریل از قارچ پنی سیلیوم کریزوژنوم جهت بهینه سازی تولید آنزیم های سلولاز و پکتیناز استفاده شد. 3 متغیر دما، ph، منبع کربن(مخلوط تفاله نیشکر و چوب خردشده خیسانده) در 2 سطح جهت بهینه سازی در نظر گرفته شد. اندازه گیری آنزیم ها و میزان گلوکز تولیدی توسط روش جذب سنجی میلر صورت گرفت. بررسی میزان اتانول توسط روش تیتراسیون دی کرومات/تیوسولفات بود.
نتایج: بهترین میزان تولید آنزیم پکتیناز و سلولاز به طور مشابهی در غلظت g/L 30 مخلوط تفاله نیشکر و چوب های خرد شده خیسانده ، PH=7 و دمای 40درجه سانتیگراد معرفی گردید. نمودار گاز کروماتوگرافی همچنین تولید اتانول در محیط تخمیر نشان داد. نتایج نشان داد که از mg/ml 8.43 گلوکز تولید شده در محیط %(v/v) 3.45 اتانول تولید گردید.
بحث و نتیجه گیری: تولید اتانول توسط پسماندهای کشاورزی، صنعتی و غیره علاوه بر اینکه باعث از بین رفتن زباله های زیستی می شود آلودگی های اتمسفری و مشکل گرمای زمین را نیز می تواند تعدیل کند. در این تحقیق میزان آنزیمی که تحت این شرایط تولید شده بود نسبت به گزارشات قبلی میزان تقریبا بالاتری را نشان داد. در نتیجه مقدار گلوکز هم بالاتر تولید شده و تولید اتانول بیشتری خواهیم داشت. تولید همزمان آنزیم سلولاز و پکتیناز همچنین سرعت تجزیه مواد را بالا برده و در نتیجه می توان به مقدار قابل توجهی از تولید اتانول دست پیدا کرد.
1
اولین همایش ملی محیط زیست دانشگاه پیام نور 1 – خرداد ماه -1393اصفهان
مقدمه:
زیست توده یکی از منابع عمده در میان انواع انرژی های نو می باشد. تعاریف متعدد و گوناگونی از این منابع شده است. تعریف اتحادیه اروپا از زیست توده عبارت است از: اجزای قابل تجزیه زیستی از محصولات، پسماندها و زائدات کشاورزی(شامل باقیمانده های گیاهی و دامی)، جنگل ها و صنایع وابسته و همچنین زائدات صنعتی و شهری قابل تجزیه. زیست توده یک منبع تجدید پذیر انرژی است که از مواد زیستی به دست می آید. بنابراین با توجه به این تعریف زباله های قابل تجزیه شهری، چوب های حاصل از هرس درختان در سطح شهر، بقایای محصولات کشاورزی و غیره سوبستراهای ارزان قیمت بسیار مناسبی هستند که می توانند توسط باکتری ها و قارچ ها تجزیه شوند. در واقع قارچ ها و باکتری ها با تولید آنزیم هایی این مواد زائد را به عنوان سوبسترا استفاده می کنند و به مواد ساده تری که جهت رشد خود نیاز دارند می شکنند. میکروارگانیسم ها با تولید آنزیم هایی مانند سلولاز، پکتیناز، گلیکوزیداز و غیره پلیمر های قندی را به گلوکز تبدیل می کنند. بنابراین میکروارگانیسم ها گزینه های مناسبی جهت از بین بردن زباله های موجود در دنیا هستند. در این تحقیق ما اثر یک سویه قارچ رشته ای پنی سیلیوم کریزوژنوم را جهت تجزیه زباله های شهری قابل تجزیه، بقایای محصولات کشاورزی و چوب های زائد و تولید اتانول بررسی کردیم.
مواد و روش ها:
میکروارگانیسم:
میکروارگانیسم مورد استفاده در این تحقیق، پنی سیلیوم کریزوژنوم بود که از مرکز کلکسیون سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران، فراهم شد. کشت ذخیره پس از رشد در محیط کشت PDA و به مدت 4 روز صورت گرفت.
محیط کشت تولید و شرایط رشد:
محیط کشتی که جهت رشد و فعالیت آنزیمی این سویه در نظر گرفته شد محیط کشت مایع حاوی: (g/L) منیزیم سولفات 7 آبه- 0.5 ، سولفات آهن- 0.01 ، پتاسیم فسفات- 1 ، سدیم نیترات- 3 بود. 3 منبع کربنی چوب های خرد خیسانده شده، پکتین حاصل از میوه (سیتروس پکتین) و تفاله نیشکر بود.
تهیه سوسپانسیون کنیدیوسپوری و شمارش با لام نئوبار:
جهت تهیه سوسپانسیون کنیدیوسپوری، آب استریل دارای مقدار 1 در هزار Tween 80 را به لوله های کشت حاوی کنیدیوسپور اضافه نموده سپس با کمک پیپت پاستور استریل به خوبی مخلوط شد تا کنیدیوسپور ها جدا شوند. برای شمارش کنیدیوسپورها و دست یافتن به پیش کشتی مناسب برای استفاده در محیط تولید، سوسپانسیون را از چند لایه پشم شیشه که درون قیفی قرار داشت رد کرده تا میسیلیوم ها جدا شوند. محلول صاف شده به خوبی ورتکس شد و با پیپت مقدار بسیار جزئی از ان بین لام و لامل نئوبار قرار داده شد. تمام مراحل در شرایط استریل انجام گردید. لام نئوبار با عدسی شیئی X25 بررسی شدکه کنیدیوسپور ها در یک مربع 16 خانه ای لام، شمرده شد و تعداد بدست آمده در 250000 ضرب گردید. عدد حاصل تعداد کنیدیوسپور ها را در یک میلی لیتر سوسپانسیون نشان می دهد و می توان با داشتن آن مقدار مناسبی از کنیدیوسپور را وارد محیط پیش کشت نمود.
2
اولین همایش ملی محیط زیست دانشگاه پیام نور 1 – خرداد ماه -1393اصفهان
پیش کشت:
بعد از شستن کنیدیوسپور ها از سطح کشت 6 روزه اسلنت PDA پس از افزودن 25 میلی لیتر آب مقطر واجد % 0.1 توئین 80 مقدار 3.5 میلی لیتر از سوسپانسیون کنیدیوسپوری به فلاسک ارلن مایر 250 میلی لیتری که دارای 50 میلی لیتر محیط مایع PDB بود اضافه شد. فلاسک ها در دمای 30 درجه برای 48 ساعت در دور 150 خوابانیده شد.
محیط تولید:
کشت های تولیدی به حجم 50 میلی لیتر در فلاسک های ارلن مایر 250 میلی لیتری تهیه و با پیش کشت تلقیح شدند و در دمای 30 درجه سانتی گراد برای 96 ساعت در دور rpm 150 پیش از استخراج محلول آنزیمی، انکوبه شدند.
استخراج محلول آنزیمی:
با اضافه کردن 22 میلی لیتر بافر فسفات 0.1 مولار (PH=6.5) به نمونه های در محیط کشت مایع، برای 30 دقیقه در 19 درجه سانتی گراد و دور شیکر rpm 140 بر روی شیکر چرخان قرار داده شد. مخلوط را از طریق کاغذ صافی واتمن فیلتر گردید. محلول بدست آمده را در دور 8000 rpm در 4 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سوپرناتانت بدست آمده جهت تعیین فعالیت آنزیم مورد استفاده قرار گرفت.
سنجش فعالیت آنزیم ها:
فعالیت آنزیم پکتیناز و سلولاز توسط روش میلر که کلوریمتریک می باشد اندازه گیری شد. در این روش 0.5 میلی لیتر از سوپرناتانت سلول های آزاد را در ه.5 میلی لیتر پکتین و سلولز به طور جداگانه که در بافر استات 0.1 مولار با PH=6 انکوبه شده است مخلوط کرده و در شرایط استاتیک برای 10 دقیقه در 40 درجه سانتی گراد انکوبه شد سپس یک میلی لیتر از معرف دی نیتروسالیسیلیک اسید به مخلوط اضافه و برای 5 دقیقه در 90 درجه سانتی گراد جوشانده شد. سپس جذب در طول موج 540 اندازه گیری گردید.
تعیین میزان گلوکز در محیط تخمیر:
جهت بدست آوردن مقدار گلوکزی که توسط قارچ تولید شده است از روش طیف سنجی میلر در حضور دی نیتروسالیسیلیک اسید استفاده می شود. مقدار جذبی که در این روش خوانده می شود میزان گلوکز را برحسب mg/ml نشان می دهد.
طراحی آزمایش و تجزیه و تحلیل آماری:
فاکتورهایی که در این تحقیق جهت بهینه سازی مورد نظر قرار گرفت مخلوطی از 2منبع کربنی مختلف (تفاله نیشکر و چوب های خرد شده خیسانده)، دما و PH بود.
منبع کربنی PH دما
g/L 15 3 20
3
اولین همایش ملی محیط زیست دانشگاه پیام نور 1 – خرداد ماه -1393اصفهان
g/L 30 7 40
در این تحقیق 8 =23 آزمایش توسط روش طراحی آزمایش فاکتوریل کامل صورت گرفت و میزان تولید آنزیم پکتیناز و سلولاز به طور جداگانه در این 8 آزمایش مورد بررسی قرار گرفت.
اندازه گیری و تولید اتانول:
بعد از بهینه سازی و پیدا کردن بهترین شرایط برای تولید آنزیم های پکتیناز و سلولاز که هر چه بیشتر باشد میزان گلوکز بیشتری را تولید خواهد کرد که این برای استفاده ساکارومایسس سرویزیه در شرایط بی هوازی برای تولید اتانول مناسب می باشد. با اضافه کردن مخمر ساکارومایسس سرویزیه به محیط کشت تخمیر در طی 7 روز صورت گرفت. جهت بررسی تولید اتانول در محیط تخمیر مقداری از محیط کشت جهت بررسی تولید اتانول به دستگاه گاز کروماتوگرافی داده شد. همچنین برای محاسبه میزان تولید اتانول از یک مقدار معین گلوکز که روش محاسبه آن شرح داده شد از روش تیتراسیون دی کرومات/ تیو سولفات استفاده گردید.
نتایج:
بهترین میزان تولید آنزیم پکتیناز و سلولاز به طور مشابهی در غلظت g/L 30 مخلوط تفاله نیشکر و چوب های خرد شده خیسانده
¡ PH=7 و دمای 40درجه سانتیگراد معرفی گردید. با بهینه سازی شرایط میزان غلظت تولید آنزیم پکتیناز و سلولاز به ترتیب
052.1 و mgml 1.410 بود. این نشان می دهد که آنزیم های تولیدی از این سویه قارچ توانایی تحمل دمای 40 درجه و دامنه pH=3-7 را دارند. اندازه گیری میزان گلوکز تولیدی در محیط تخمیر توسط روش میلر حدود mg/ml 8.43 بود که از این مقدار گلوکز 3.45 %(v/v) اتانول بدست آمد.
