بخشی از مقاله
چکیده:
سلولهاي حیوانی با توجه به ظرفیت بالا در ایجاد فولدینگ مناسب، اسمبل کردن پروتئین ها و تغییرات بعد از ترجمه، سیستم بیانی غالب براي تولید انواع پروتئین هاي نوترکیب داروئی می باشند - . - 1 در سلولهاي یوکاریوت، بیان ژن یک پروسه بسیار پیچیده است که تحت تاثیر مکانیسم هاي متفاوتی مثل تغییرات کروماتین، رونویسی، تغییرات بعد از رونویسی، انتقال mRNA به داخل سیتوپلاسم، تجزیه mRNA ، ترجمه، ترشح، تغییرات بعد از ترجمه و فولدینگ پروتئین تنظیم می گردد - . - 2 .
پروژه حاضر با هدف تولید ماده موثره اولیه آنتی بادي منوکلونال داروئی تراستوزومب - - 3 بصورت بیوسیمیلار و در مقیاس آزمایشگاهی طرح ریزي گردیده است. در این تحقیق از سلول مهندسی شده CHO DG44 براي کوترانسفکشن کلون هاي حاوي ژن زنجیره سبک و سنگین آنتی بادي مورد نظر استفاده شد. کلونال سلکش در محیط نیمه جامد و ژنومیک امپلی فیکیشن با متوترکسات استراتژي هاي دیگري هستند که براي رسیدن به حداکثر بیان در این سیستم بکار گرفته شدند.
مقدمه:
با توجه به افزایش تقاضا براي تولید آنتی بادیهاي منوکلونال داروئی، توسعه رده هاي سلولی پایدار با توان تولید بالا یک چالش اساسی در صنعت داروسازي می باشد - . - 4 استفاده از رده سلولی CHO DG44 یکی از رایج ترین سیستم ها براي بیان بالاي پروتئین نوترکیب می باشد - . - 5 این سلول داراي نقص ژن دهیدروفولات ردوکتاز - DHFR - می باشد. بنابراین چنانچه از یک وکتور بیانی حاوي ژن DHFR در بیان پروتئین مورد نظر استفاده گردد، علاوه بر امکان سلکشن سلولهاي مثبت در محیط فاقد هیپوگزانتین و تایمدین - HT - می توان از این خصوصیت در افزایش تعداد نسخه هاي ژنی به روش ژنومیک امپلی فیکیشن با متوترکسات استفاده نمود.
در اینحالت تعداد نسخه هاي ژن DHFR و به تبع آن ژنی که به همراه آن ترانسفکت شده است براي مقابله با اثر مهاري متوترکسات در جذب HT محیط بالا رفته، همزمان منجر به بیان پایدار پروتئین مورد نظر می گردد - . - 6-7 خصوصیت فوق در بیان آنتی بادي منوکلونال داروئی تراستوزومب مورد استفاده قرار گرفت. در این تحقیق ابتدا ژن زنجیره سبک آنتی بادي بر روي وکتور pcDNA 3.3-TOPO و ژن زنجیره سنگین آنتی بادي بر روي وکتور - pOptiVEC TOPO قرار داده شد. سپس هر دو وکتور بطور همزمان به داخل سلول مهندسی شده CHO DG44 ترانسفکت گردیدند. در این شرایط انتخاب ژن مربوط به زنجیره سبک با استفاده از حضور آنتی بیوتیک جنتیسین در محیط و انتخاب ژن مربوط به زنجیره سنگین با استفاده از محیط فاقد HT صورت می پذیرد.
نتایج نشاندهنده بیان بالاي ژن زنجیره سبک و بیان بسیار کم ژن زنجیره سنگین در تک کلون هاي مولدي بود که بعد از مرحله کلونال سلکشن به دست آمده بودند. در اینحالت هفت راند ژنومیک امپلی فیکیشن با متوترکسات براي افزایش بیان ژن زنجیره سنگین انجام شد. در نهایت کانسترکت هایی بدست آمد که داراي تولید مقادیر متناظر از زنجیره سبک و سنگین مشابه با الگوي آنتی بادي تجاري هرسپتین بودند.
مواد و روشها:
.1 کلونال سلکشن در محیط نیمه جامد
کلونال سلکشن در محیط نیمه جامد طی مراحل مختلف زیر انجام شد:
- رقیق سازي سلولهاي مولد و کشت آنها در پلیت هاي کشت 96 خانه با هدف دست یابی به تک کلون هاي مولد تولیدي
- اسکرینینگ در محیط نیمه جامد [CloneMatrix semi-solid concentrates - Genetix - ] براي جداسازي تک کلون ها Scale up - تک کلون هاي مولد از داخل پلیت هاي 96 خانه به داخل پلیت هاي 48 خانه، 24 خانه، 12 خانه، 6 خانه، فلاسک هاي 25 ، فلاسک هاي 75 و در نهایت ارلن هاي 125 میلی لیتري براي دستیابی به بهترین کلون هاي پایدار تولیدي - فریز نمودن براي حفظ سلولهاي ترانسفکت شده و مولد در طی هر مرحله از کار.
.2 ژنومیک امپلی فیکیشن با متوترکسات
آمپلی فیکاسیون سلولها با استفاده از غلظت هاي افزایش یابنده متوترکسات - 500nM, 700nM, 850 nM, 1µM, 2µM, 4µM - در محیط کشت سلولها طی هفت ران از سلکشن براي افزایش تعداد نسخه هاي ژن زنجیره سنگین در سلولهایی که هر دو کانستراکت حاوي ژن زنجیره سبک و سنگین را بصورت پایدار دریافت نموده بودند، انجام شد.
.3 مولتی پلکس PCR
آزمون مولتی پلکس PCR براي بررسی حضور زنجیره هاي سبک و سنگین آنتی بادي منوکلونال داروئی تراستوزومب در داخل ژنوم کانسترکت هاي بدست آمده در طی مراحل مختلف کلونال سلکشن گذاشته شد. براي این منظور ابتدا DNAي ژنومی سلولهاي ترانسفکت شده با استفاده از کیت - - Genomic DNA Purification Kit, Promega استخراج شد. PCR مطابق دستورالعمل هاي استاندارد انجام پذیرفت بجز اینکه در هر واکنش، همزمان از دو جفت پرایمر استفاده گردید. در این مرحله از پرایمرهاي موجود براي وکتورهاي pOptiVEC -TOPO TA Vector و pcDNA 3.3-TOPO TA Vector استفاده شد. به عنوان نمونه کنترل منفی از سلول CHO DG44 ترانسفکت نشده و بعنوان نمونه کنترل مثبت از پلاسمیدهایی که قبلا حضور ژن مورد نظر در آنها به روش تعیین توالی تائید شده بود، استفاده گردید.
4. SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ
براي انجام SDS-PAGE از روش لاملی و همکاران - 1972 - استفاده شد. نمونه ها در دو حالت احیا - با افزودن - 2-ME و غیر احیا - عدم حضور - 2-ME آماده شدند. وسترن بلاتینگ همچنین بر روي غشاء PVDF و با استفاده از آنتی بادي anti-Human IgG1 کونژوگه شده با آلکالین فسفاتاز مطابق پروتکل هاي استاندارد صورت پذیرفت.
نتایج و بحث:
پروژه حاضر با هدف دستیابی به تک کلون هاي مولد حاوي طول کامل زنجیره هاي سبک و سنگین آنتی بادي منوکلونال داروئی تراستوزومب طی مراحل مختلفی صورت پذیرفت. در ابتدا طول کامل هر کدام از زنجیره هاي سبک و سنگین آنتی بادي منوکلونال داروئی تراستوزومب با در نظر گرفتن توالی هاي مناسب براي آغاز و خاتمه رونویسی و ترجمه در وکتور یوکاریوتی طراحی و ساخته شد. سپس هر کدام از زنجیره ها در داخل شاتل وکتورهاي pOptiVEC-TOPO و pcDNA 3.3 TOPO ترانسفورم گردیدند.
بعد از انجام مراحل سلکشن در وکتور پروکاریوتی، کانسترکت هایی که هر زنجیره را بطور کامل و در جهت درست دریافت کرده بودند، انتخاب شدند و براي ترانسفورمیشن در میزبان یوکاریوتی - CHO DG44 - مورد استفاده قرار گرفتند. ترانسفورمیشن با استفاده از پروتکل هاي استاندارد و یکسري تغییرات جزیی صورت پذیرفت و در نهایت طی مراحل مختلف سلکشن سلولهایی که هر دو کانسترکت حاوي ژن زنجیره سبک و سنگین را دریافت کرده بودند، انتخاب شدند.
در مرحله بعد کلونال سلکشن در محیط نیمه جامد با هدف دستیابی به تک کلون هاي مولد پایدار بیان کننده ژن زنجیره سبک و سنگین آنتی بادي منوکلونال داروئی تراستوزومب بر روي محیط نیمه جامد طی مراحل متعدد انجام پذیرفت. در این مرحله از میان جمعیت ترانسفکت شده اولیه 18 کانسترکت بدست آمد که به ترتیب با اسامی STD3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,20,21 نام گذاري شدند. یک نمونه از کلون هاي تک سلولی بدست آمده در محیط کشت نیمه جامد در شکل یک نشان داده شده است.
زنجیره سبک و زنجیره سنگین
بدنبال این مرحله براي تایید بیان پروتئین اختصاصی از آزمون هاي SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ استفاده شد. SDS-PAGE بر روي ژل 10% براي نمونه هاي سوپ سلولی که بعد از تغلیظ با سانتري پرب بدست آمده بودند، صورت پذیرفت و بدنبال آن نمونه ها بر روي غشا PVDF منتقل گردیدند. در اکثر نمونه هاي بدست آمده از سوپ سلولی، باند مربوط به زنجیره سبک در محل وزن مولکولی 28 KDa بصورت یک باند پهن مشاهده شد، در حالیکه باند مربوط به زنجیره سنگین خیلی قابل تمیز نبود - شکل سه، چپ - . در این مرحله با توجه به اینکه ژن زنجیره سنگین همراه با وکتور pOptiVEC و در کنار ژن DHFR، به داخل سلولها اینتگره شده بود، امکان ژنومیک آمپلی فیکیشن با متوترکسات براي اینتگریشن نسخه هاي بیشتري از ژن زنجیره سنگین به داخل ژنوم سلولها وجود داشت.
