بخشی از مقاله
چکیده
فوزاریوم سنبله - Fusarium head blight: FHB - یا اسکب گندم یکی از بیماریهای مخربی است که هرساله میلیونها دلار خسارت به غلات کشت شده در سراسر جهان وارد میکند و ایجاد واریتههای مقاوم، اقتصادیترین و مؤثرترین روش کنترل این بیماری میباشد. این تحقیق بر روی 25 رقم بومی، اصلاحشده و لا ینهای پیشرفته اصلاحی گندم - حاصل پنج نسل بککراس فلات بهعنوان تکرار شونده و سومایتری بهعنوان والد غیرتکراری - بهمنظور شناسایی بوتههای مقاوم به بلایت فوزاریومی سنبله با استفاده از ارزیابیهای فنوتیپی وژنوتیپی انجام شد. بوتهها در مزرعه مورد آلودگی مصنوعی قرار گرفتند سپس FDK مورد محاسبه قرار گرفت گروهبندی ژنوتیپ ها با استفاده از تجزیه خوشهای - کلاستر - به روش UPGMA و فاصله اقلیدسی بهعنوان معیار فاصله انجام گرفت. نتایج حاصل از تجزیه کلاستر بوتهها را به سه گروه تقسیم کرد سپس DNA نمونههای FDK پایین استخراج شد و بهوسیله آغازگر UMN10 مورد بررسی قرار گرفت.همانطور که انتظار میرفت کلیه نمونههای مقاوم گروه اول باند مربوطه را نشان دادند که حاکی از انتقال موفق ژن fhb1 به این لاین ها میباشد.ک
لمات کلیدی: مقاومت به بلایت فوزاریومی سنبله گندم، درصد دانههای آلوده - - FDK، تجزیه خوشهای،آغازگر umn10، استخراج DNA
.1 مقدمه
با توجه به افزایش رشد جمعیت و نیاز به تأمین امنیت غذایی، افزایش تولید در واحد سطح محصولات زراعی میتواند به عنوان یک راهبرد اساسی در حل مشکل تامین غذا به شمار آید. درمیان گیاهان زراعی، گندم با دارا بودن مواد غذایی باارزش مانند انواع پروتئین ها، ویتامین ها و مواد معدنی، حدود % 25 کالری غذایی مردم جهان را تأمین مینماید - سالونخه و همکاران، . - 1985 با توجه به محدودیتهای افزایش سطح زیرکشت گندم و پایین بودن میانگین عملکرد گندم در کشور افزایش عملکرد میتواند یکی از راه کارهای عملی برای پاسخگویی به نیازهای کشور باشد. از عواملی که باعث کاهش عملکرد در واحد سطح میگردند، میتوان به تنشهای غیر زیستی و تنشهای زیستی مانند آفات و بیماری ها اشاره نمود. یکی از تنشهای زنده، بیماری بلایت کهعموماً تحت FHB فوزاریومی سنبله گندم1 یا عنوان اسکب 2 نامیده میشود، یکی از بیماری های مخرب در مناطق گرم و مرطوب کشت گندم در بیماری جهان میباشد - بای و شانر، . - 1994 فوزاریومی سنبله یکی از بیماری های مهم گندم در استان های مازندران، گلستان، زنجان، فارس و اردبیل - دشت مغان - به شمار میرود - ملیح پور و همکاران، . - 2000
در چند سال گذشته به علت وجود منابع آلودگی، کشت ارقام حساس به بیماری و مهیا بودن شرایط جوی در مناطق شمالی کشور، خسارت ناشی از این بیماری بسیارچشمگیر بوده است - ملیح پور و همکاران،2000؛ گلزار، 1989؛ فروتن و همکاران، . - 1993 روشهای متداول اصلاح نباتات مبتنی بر انتخاب گیاهان در مزرعه یا شرایط محیط کنترل شده بر اساس فنوتیپ میباشد، اما در کنار روش های متداول، تکنیک های جدید مولکولی این امکان را فراهم میسازد که انتخابمستقیماً در سطح ژنوتیپ - - DNA انجام گیرد و بنابراین باعث افزایش دقت بیشتر گزینش، صرفه جویی در زمان واحتمالاً ارزیابیهای پرهزینه میگردد - بورست مایر و همکاران، . - 2002
فرآیند انتخاب برای مقاومت به اسکب سنبله بر مبنای ارزیابی فنوتیپی از طریق برآورد درصد دانههای آسیب دیده از فوزاریوم - FDK - در دانه پس از برداشت حاصل میشود - بای و شانر، . - 1994 به هر حال، ارزیابی فنوتیپی FHB زمانبر، پرهزینه و اغلب غیردقیق است. به علاوه، بیان فنوتیپی مقاومت به FHBعمدتاً تحتتأثیر شرایط جوّی قرار میگیرد - بای و شانر، . - 2004 با توجه به این حقایق، نشانگرهای مولکولی یک ابزار بسیار مفید برای اصلاح مقاومت به FHB فراهم میکنند - بای و شانر،2004؛ کلب و همکاران،2001؛ ون سانفورد و همکاران. - 2001 سومای - sumai3 - 3 یک واریته گندم مقاوم چینی است که به گسترش قارچ درون سنبله آلودهشده مقاومت دارد و یکی از مهمترین منابع مقاومت به بلایت فوزاریومی سنبله در سرتاسر جهان به شمار میرود - کلب و همکاران، . - 2001 یکی از مهمترین QTLهای مقاومت به فوزاریوم، Fhb1 - معادل - Qfhs.ndsu-3BS مشتق از رقم سومای3 است که در یک جمعیت اینبرد لاین شناساییشده است - والدرون و همکاران، - 1999 نشانگر پیوسته به این QTL، نشانگرUMN10 است که روی کروموزوم 3BS قرار دارد و اندازه مورد انتظار محصول این نشانگر 240 جفت باز برای رقم مقاوم گزارش شده است - لیو و همکاران، . - 2008بر همین اساس، هدف از این تحقیق ارزیابی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت به بلایت فوزاریومی سنبله در برخی ژنوتیپهای بومی و اصلاح شده و لاینهای پیشرفته اصلاحی گندم نان میباشد.
.2 مواد و روشها
.1-2 آزمایشات مزرعه ای
این تحقیق بر روی 25رقم بومی، اصلاحشده و لاینهای پیشرفته اصلاحی گندم - حاصل پنج نسل بککراس فلات به عنوان تکرار شونده و سومایتری به عنوان والد غیرتکراری - به منظور شناسایی بوتههای مقاوم به بلایت فوزاریومی سنبله با استفاده از ارزیابیهای فنوتیپی انجام شد. سومایتری - sumai3 - یک واریته گندم مقاوم چینی است که به گسترش قارچ درون سنبله آلوده شده مقاومت دارد و یکی از مهمترین منابع مقاومت به بلایت فوزاریومی سنبله در سرتاسر جهان به شمار میرود - کلب و همکاران، . - 2001 رقم بهاره فلات که در مرکز سیمیت ایجاد شده است، با وجود خصوصیات مطلوب زراعی و سطح زیر کشت زیاد در ایران، نسبت به FHB بسیار حساس میباشد - گلزار و همکاران،. - 1998
ابتدا ژنوتیپهای مورد بررسی در مزرعه کشت شده و مراقبتهای معمول زراعی طی دورهی رشد، روی گیاهان اعمال شد. برای تهیه مایه تلقیح، در ارلنهای به حجم 250 میلیلیتر مقدار 2/5 گرم کاه گندم آسیاب شده به همراه 125 میلیلیتر آب مقطر ریخته شده و در اتوکلاو استریل شدند، عمل استریل کردن سه مرتبه تکرار گردید. قطعه کوچکی به قطر حدود 3-5 میلیمتر از میسلیومهای جدایه مورد نظر به همراه محیط کشت برداشته شده و در داخل ارلنها ریخته شد. سپس ارلنها در دمای 25-30 درجه سانتیگراد روی شیکر دورانی گذاشته شد. پس از گذشت حدود 96 ساعت اسپورهای فراوانی از جدایه مورد نظر به دست آمد. مایه تلقیح تهیه و تا زمان استفاده در دمای چهار درجه سانتیگراد نگهداری شد. غلظت سوسپانسیون کنیدی به 5×104 اسپور در هر میلیلیتر تنظیم گردید. اندازهگیری قدرت تهاجم مایه تلقیح در آغاز و پایان دوره آلودگی نشان داد که توانایی تهاجم در طول دوره آلودگی ثابت بوده است. آلودگی مصنوعی در زمانی که بیش از 50 درصد گیاهان به مرحله گلدهی رسیده بودند، به دو صورت اسپورپاشی با سوسپانسیون و تزریق اسپور به گلچههای میانی سنبله انجام شد.
بعد از افشانه کردن، سنبلههای آلوده شده توسط یک پوشش پلاستیکی به منظور نگهداری رطوبت به مدت 24 ساعت پوشانیده شدند. درصد دانههای آلوده سنبله توسط شاخصی بر مبنای صفر درصد - بدون بیماری - تا 100 درصد - آلودگی کامل - ، 10، 15، 20 و 25 روز پس از آلودگی ارزیابی شد. مقدار درصد دانههای آلوده - FDK - برای هر گیاه محاسبه گردید. برای گروهبندی ارقام از روش چند متغیرهی تجزیه خوشهای - کلاستر - استفاده شد. تجزیه خوشهای به روش UPGMA و فاصله اقلیدسی به عنوان معیار تشابه انجام گرفت. برای تجزیه دادهها از نرم افزار NTSYSpc 2.02e استفاده شد - شکل . - 1
.2-2 آزمایشات مولکولی
بهمنظور انجام آزمایشات مولکولی از برگ پرچم هر بوته نمونهبرداری شد، نمونهها با ازت مایع کوبیده و DNA آنها به روش CTAB استخراج شد. برای بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراجشده از روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز 0/1 درصد استفاده شد. برای بررسی کیفیت و عدم شکستگی DNA، 5 میکرولیتر از نمونههای DNA بر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز گردید. در روش اسپکتروفتومتری، 2 میکرولیتر DNA استخراجشده با 198 میکرولیتر آب دو بار تقطیر استریل مخلوط شد و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر BioPhotometr مدل Eppendorf ضریب جذب نوری 230، 260، 280 و 320 اندازهگیری شد. جهت اندازهگیری خلوص یا همان کیفیت DNA از نسبت جذب نوری محلول DNA در طولموج 260 نانومتر به 280 نانومتر - r=260/280 - که شاخص میزان خلوص DNA میباشد استفاده شد. تکثیر DNA ژنومی توسط تکنیک PCR با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی برای مکان ژنی fhb1 بر روی دستگاه ترموسایکلر ساخت شرکتهای کوبرت و بک لب صورت گرفته شد. به این صورت که در یک تیوب اجزای واکنش را به ترتیب: آب استریل، بافر تکثیر، dNTP، آغازگرها، DNA الگو و درنهایت DNA پلیمراز که واکنش را انجام میدهد با یکدیگر مخلوط شد و در دستگاه قرار گرفت .محصول DNA تکثیرشده بعد از الکتروفروز آگارز 2 - درصد - و رنگآمیزی با سایبرگلد بهمنظور عکسبرداری بر روی دستگاه ژل اسکن قرار داده شد. باندها مشاهده و ژنوتیپها به دو گروه مقاوم و حساس طبقهبندی شدند - شکل. - 2
.3 نتایج و بحث
نتایج گروهبندی ارقام با روش کلاستربندی شجرهای UPGMA براساس فاصله اقلیدسی در نمودار درختی شکل 1 نشان داده شده است. بر اساس این گروهبندی ژنوتیپهای مورد مطالعه به سه گروه تقسیم شدند. گروه اول شامل 5 بوته 66، 136، 183، 273، 304، گروه دوم شامل 11 بوته به شمارههای 157، 262 ، 135، 227 ، 13 ، 193، 282، 117، 263، 100، 198،گروه سوم شامل 9 بوته به شمارههای 10، 165، 178، 223، 124، 123، 177، 197/2، 11 بود.
