بخشی از مقاله
چکیده
این تحقیق براي بررسی الکتروفورزي تغییرات پروتئینی در واکنش به آلودگی ناشی از ویروس موزائیک رگهاي گندم - WSMV - در نسل F2 دو رقم گندم مقاوم - کراسعدل - و حساس - مرودشت - ، در دانشگاه شیراز در بین سالهاي -1388 1387 انجام شد. بذور ژنوتیپها - کراسعدل، مرودشت و F2ها - در گلخانه کشت و ده روز پس از کشت با ویروس WSMV تلقیح شدند. برگ گیاهچهها در زمانهاي مختلف براي آنالیز الکتروفورزي باندهاي پروتئینی برداشت شدند. پروتئینهاي محلول استخراج و الکتروفورز با روش SDS-PAGE انجام شد. الگوي الکتروفورزي SDS-PAGE پروتئینها نشان داد، دو گروه از پلیپپتیدها با وزن مولکولی 14 و 52 کیلودالتون در رقم مرودشت و F2هاي حساس مایهزنی شده نسبت به آلودگی ویروسی کاهش یافتند ولی در رقم مقاوم کراسعدل و F2هاي مقاوم تغییر معنیداري مشاهده نشد.
پلی پپتیدهایی با وزن مولکولی 52 کیلودالتون زیرواحد بزرگ ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز - RuBPCase - و پلیپپتیدهایی با وزن مولکولی 14 کیلودالتون زیرواحد کوچک RuBPCase میباشند. پلیپپتیدهایی با وزن مولکولی 14 و 52 کیلودالتون که در آلودگی با ویروس موزائیک رگهاي گندم کاهش مییابند، احتمالا زیرواحد کوچک و بزرگ RuBPCase هستند . بنابراین کاهش پلی پپتیدهاي زیرواحد بزرگ و کوچک RuBPCase احتمالا مسئول کاهش فعالیت آن در رقم مرودشت و F2هاي حساس مایه زنی شده است و بررسی الکتروفورزي تغییرات پروتئینی در پاسخ به آلودگی ناشی از ویروس موزائیک رگهاي گندم - WSMV - میتواند به عنوان نشانگر در گزینش براي مقاومت به WSMV در نظر گرفته شود.
کلمات کلیدي: گندم، WSMV، الکتروفورز و نسل F2
مقدمه
از جمله عواملی که باعث کاهش محصول گندم شده، آفات و بیماريها هستند و از جمله بیماريهاي مهم در ایران، بیماري هاي ویروسی گندم میباشد . - 1 - موزائیک رگهاي گندم که بوسیله ویروس موزائیک رگهاي گندم ایجاد میشود، یکی از بیماري هاي مهم است که باعث خسارت شدید محصول در مناطق عمده تولید گندم در ایران میشود . از روشهاي مبارزه با زیانهاي اقتصادي ناشی از WSMV بیش از همه یافتن ژنهاي مقاوم و تولید ارقام مقاوم مورد توجه قرار گرفته است . - 7 - در ارزیابی مقاومت به WSMV در ایران براي شناسایی ژنوتیپهاي مقاوم، رقم کراسعدل به عنوان یک رقم صددرصد مقاوم در برابر سویه شیراز، با درصد آلودگی صفر گزارش شده است . - 15 - گیاهان داراي مکانیسمهاي دفاعی براي جلوگیري از هجوم سایر موجودات زنده و یا براي کاهش دادن اثرات منفی از هجوم عوامل بیماريزا میباشند. فرآیندهاي بیوشیمیایی متفاوت منجر به فعال شدن سریع آنزیمها، تغییرات ساختمانی در ترکیبات سلولی، تغییر مسیرهاي بیوشیمیایی و ایجاد پیامهاي بینسلولی ودرونسلولی میشود که از ترفندهاي دفاعی گیاهان میباشد . - 11 -
مقاومت به عوامل بیماريزا شامل تغییراتی در سنتز پروتئین کل - 10 - ، فعال سازي یا تولید پپتیدها یا پروتئینهاي دفاعی - 3 - و تولید سریع انواع اکسیژن فعال - 4 - - ROS - می شود. پروتئینهاي وابسته به بیماري بعد از حمله عامل بیماريزا تولید شده و با پیشرفت مقاومت فراگیر بدنی در برابر آلودگی بیشتر توسط قارچها، باکتريها و ویروسها همبستگی دارد . - 12 - در تحقیقی بر روي تغییرات پروتئینی در گندم آلوده به ویروس موزائیک رگهاي گندم، آنالیز پروتئینها با الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید نشان داد که میزان پروتئینهاي خاصی در شرایط آلودگی کاهش یافته است و در گروه دیگري از پروتئینها افزایش نسبی مشاهده شد و دستهاي دیگر از پروتئینهاي پوششی ویروس نیز افزایش یافت . - 13 - هدف از این تحقیق، بررسی ارتباط توسعه علائم WSMV و تغییرات باندهاي پروتئینی در ارقام کراسعدل، مرودشت و نسل F2 تلاقی این دو رقم میباشد.
مواد و روشها
این تحقیق بین سالهاي 1387-1388 در گلخانه و آزمایشگاههاي مرکز ویروسشناسی گیاهی واقع در دانشکده کشاورزي دانشگاه شیراز انجام شد. بذور در گلدانهایی با قطر 50 سانتی متري با خاك سترون در اتاقک رشد و در دماي 20-25 درجه سانتی در دو آزمایش مجزا - با آلودگی و شاهد - کاشته شدند . گیاهچههاي گروه اول،10 روز پس از کشت با WSMV مایهزنی شدند و گیاهچههاي گروه دوم بعنوان شاهد در نظر گرفته شدند. اولین نمونهبرداري از برگها یک ساعت بعد از انجام تلقیح و نمونهبرداريهاي بعدي به فواصل زمانی 1، 2، 8 و 20 روز بعد از انجام تلقیح انجام شد.
براي بررسی الکتروفورزي تغییرات پروتئینی نمونه برداري از جوانترین برگها صورت گرفت. براي تعیین غلظت پروتئین از روش - 1976 - Bradford استفاده گردید. جهت بررسی تغییرات پروتئینی در شرایط بیماري از روش الکتروفورز روي ژلهاي صفحهاي پلی آکریل آمید استفاده شد. نمونهها شامل مقدارهاي مساوي از پروتئین تیمارهاي مختلف جهت الکتروفورز SDS-PAGE بر طبق روش - 1970 - Laemmli می باشند. ژل پایین 12 درصد و ژل بالا 5 درصد تهیه شد. پس از تهیه ژل و قرار دادن آن روي دستگاه الکتروفورز عمل هواگیري انجام و چاهکها بارگیري شدند. به این منظور یک حجم بافر نمونه - 5x - به 4 حجم نمونه پروتئین اضافه گردید و توسط سمپلر مناسب مقدار 30 میکرولیتر از هر نمونه با دقت در چاهک ریخته شد. مارکر پروتئینی نیز در چاهک کناري ریخته شد.
دستگاه به منبع برق وصل گردید و ولتاژ منبع برق بر روي 140 ولت و شدت جریان آن بر روي 30 میلیآمپر تنظیم شد. هنگامی که رنگ نشانگر - محلول رنگی حاوي بروموفنول - به نزدیکی انتهاي ژل رسید دستگاه خاموش گردید . رنگآمیزي با کوماسی آبی R-250 صورت گرفت. ژل در ظرف قرار داده شد و از محلول رنگآمیزي به آن اضافه شد و به مدت یک شب روي شیکر با حرکت آرام قرار داده شد. سپس محلول رنگآمیزي تخلیه،ژل را کاملاً با آب معمولی شسته و محلول رنگبر اضافه شد و روي شیکر قرار داده شد. پس از تیره شدن محلول رنگبر با محلول تازه تعویض شد. این عمل چند بار تکرار گردید تا زمینه ژل به طور کامل شفاف شده و باندهاي پروتئینی به وضوح دیده شوند.
با رسم منحنی کالیبراسیون میتوان وزن مولکولی پروتئین نامعلوم را مشخص کرد. بدین منظور روي محور x میزان تحرك نسبی - Rf - و روي محور y لگاریتم وزن مولکولی نمونههاي استاندارد را قرار میدهند و از اتصال نقاط حاصل منحنی مورد نظر به دست میآید. مقدار تحرك نسبی عبارت است از فاصله طی شده توسط پروتئین از مبدأ به فاصله نقطه مرجع از مبدأ. غالبا نقطه مرجع را نقطهاي که رنگ نشانگر - بروموفنول - به آن رسیده است در نظر میگیرند و مبدأ همان ابتداي ژل جداکننده است. بنابراین فاصله طی شده توسط هر یک از پروتئینها از مبدأ با خطکش از روي ژل تعیین شد و بعد از رسم منحنی کالیبراسیون Rf پروتئینهاي مجهول به دست آمد و سپس با استفاده از منحنی استاندارد وزن ملکولی آنها مشخص شد.
نتایج و بحث
در ارقام کراس عدل و مرودشت تعدادي باند پلیپپتیدي مشاهده شد. دو گروه از پلیپپتیدها با وزن مولکولی 14 و 52 کیلو دالتون در رقم حساس مرودشت و F2هاي حساس نسبت به آلودگی ویروسی واکنش نشان دادند و میزان تجمع آن کاهش یافت، ولی در رقم مقاوم کراسعدل و F2هاي مقاوم کاهشی در این دو گروه پلیپپتید در شرایط مایهزنی نسبت به شرایط عدم مایهزنی مشاهده نشد.زیرواحدهاي روبیسکو آنزیمی که نقش مهمی در فتوسنتز و تثبیت کربن در استروماي کلروپلاست ایفا می کند داراي پلیپپتید هایی با وزن مولکولی 14 و 52 کیلودالتون میباشد. بیش از %40 از کل پروتئینهاي محلول اکثر برگها را رابیسکو تشکیل میدهد. روبیسکو از هشت زیر واحد بزرگ - L - که جرم مولکولی هر یک در حدود 52 کیلودالتون میباشد، تشکیل شده است. در آنزیم روبیسکو هشت زیر واحد کوچک - S - نیز وجود دارد که جرم مولکولی هر کدام در حدود 14 کیلودالتون میباشد و نقش آنها ناشناخته است.
ژن مربوط به زیرواحدهاي بزرگ به وسیله ژنوم کلروپلاست کد میشود و این زیرواحدها به کمک ریبوزمهاي سیتوزولی ساخته میشوند و به کلروپلاست منتقل میگردند و در آنجا به زیر واحدهاي بزرگ متصل و مولکول L8S8 را تشکیل میدهند . - 5 - پلیپتیدهایی با وزن مولکولی 14 و 52 کیلودالتون که در آلودگی با ویروس موزائیک رگهاي گندم کاهش مییابد، احتمالا زیر واحد کوچک و بزرگ ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز هستند چرا که در رقم حساس مرودشت و نسل F2 حساس آلودگی ویروسی با علائم نکروز و کاهش کلروفیل همراه بوده است و به دلیل اینکه بیش از % 40 از کل پروتئین محلول اکثر برگها را این آنزیم تشکیل میدهد بنابراین بسیاري از پلیپپتیدهایی که در آلودگی ویروسی غلات کاهش مییابند به عنوان پروتئین هاي کلروپلاستی شناسایی میشوند.
کاهش ریبوزومهاي کلروپلاستی و در پی آن ریبولوز بیس فسفات کربوکسیلاز براي توتون آلوده شده به ویروس موزائیک توتون - 9 - و کلم چینی آلوده شده با ویروس موزائیک زرد شلغم - 8 - گزارش شده است. همانطور که نتایج حاصل از الکتروفورز یک بعدي نشان داد دو گروه از پلیپپیتیدها با وزن مولکولی 14 و 52 کیلودالتون در ژنوتیپهاي حساس نسبت به آلودگی ویروسی واکنش نشان داد و میزان تجمع آنها کاهش پیدا کرد. آلودگی ویروسی با علائم کلروزه برروي فتوسنتز موثر میباشد و کاهش میزان فتوسنتز با کاهش میزان کلروفیل همبستگی دارد . - 14 - بنابراین میتوان گفت که کاهش محتواي پروتئین کل در نتیجه تخریب کلروپلاستها یا جلوگیري از سنتز پروتئینها میباشد و بررسی الکتروفورزي تغییرات پروتئینی در پاسخ به آلودگی ناشی از ویروس موزائیک رگهاي گندم - WSMV - می تواند به عنوان نشانگر در گزینش براي مقاومت به WSMV در نظر گرفته شود.
