بخشی از مقاله
چکیده
به منظور مکانیابی ژنهاي مرتبط با شاخصهاي تحمل به تنش خشکی در لاینهاي دابلد هاپلوئید نان در شرایط تنش خشکی آخر فصل و تعیین مناسبترین معیار انتخاب در شرایط تنش، 93 لاین دابلد هاپلوئید به همراه دو والد در شرایط مزرعه بدون تنش - معمول منطقه - و تنش خشکی - قطع آبیاري از مرحله گلدهی - در قالب طرح بلوكهاي کامل تصادفی در سه تکرار در سال زراعی 88 - 89 در مزرعه تحقیقات کشاورزي دانشگاه شهرکرد مورد ارزیابی قرار گرفتند . عملکرد دانه در دو محیط اندازهگیري شد و بر مبناي آن شاخصهاي مرتبط با تنش تحمل خشکی از جمله TOL ، STI، SSI و GMP ، برآورد شدند .
پس از استخراج DNA از نمونههاي برگی جوان، تعداد 30 جفت پرایمر SSR چند شکل روي کل افراد جامعه آزمون شدند. تجزیه دادههاي فنوتیپی بیانگر توزیع نرمال براي شاخصهاي تحمل و وجود تفکیک متجاوز در جامعه مورد مطالعه بود. بالاترین ضرائب همبستگی بین شاخصهاي MP، GMP و STI و عملکرد در دو محیط تنش و بدون تنش مشاهده گردید. مکانیابی ژنهاي مرتبط با شاخصهاي تحمل به تنش خشکی نشان داد که براي شاخص TOL یک QTL روي کروموزم1B، براي STI دو QTL روي کروموزمهاي 4A و 5A ، براي SSI دو QTL روي کروموزم2B، و براي GMP یک QTL روي کروموزم 5A شناسایی گردید. که در کل بین 10 تا 20 درصد از تنوع این شاخصها را توجیه مینمایند.
مقدمه
گندم - Triticum aestivum L. - مهمترین محصول کشاورزي ایران و جهان است. بیش از 30درصد اراضی زیر کشت - حدود 238 میلیون هکتار از 760 میلیون هکتار - را این محصول به خود اختصاص داده است. گندم غذاي عمده انسانهاست که به اشکال متفاوت مصرف میشود
خشکی مهمترین تنش محیطی است که بطور معمول حدود 50 درصد از 238 میلیون هکتار کشت سالانه گندم دنیا را تحت تاثیر خود قرار میدهد . - 7 - حدود چهار پنجم مساحت زمینهاي جهان در محدوده مناطق خشک و نیمه خشک قرار دارد، در این مناطق آب عامل اصلی محدود کننده تولیدات گیاهی است این محدودیت باعث شده است که تولید خالص گیاه کاهش یابد . - 9 - این موضوع مبین نیاز به توجه بیشتر و استفاده از تمامی پتانسیلها از جمله روش اقتصادي و با ثبات افزایش تحمل به خشکی گیاهان است.
نظر به این که ساختار یک صفت کمی همچون تحمل به خشکی در هر فرد و ظهور فنوتیپ آن به شدت تحت تاثیر عوامل محیطی است، لذا یکی از موانع اطلاع از کنترل صفات کمی وجود اثرات متقابل ژنوتیپ و محیط است. بنابراین آزمایش نهایی براي پی بردن به ژنوتیپهاي مقاوم به خشکی پی بردن به وضعیت عملکرد آنها در شرایط خشک است. با توجه به این مطالب کمی کردن شاخصهاي تحمل به خشکی باید بر مبناي عملکرد گیاه در شرایط خشک صورت گیرد . - 1 - ،براي انتخاب ژنوتیپها بر مبناي وضعیت عملکرد آنها در محیطهاي داراي تنش و بدون تنش شاخصهاي متعددي از جمله TOL ، STI، SSIو GMP پیشنهاد شده است
استفاده از نشانگرهاي ملکولی، بویژه نشانگرهاي مکان اختصاصی همانند ریزماهوارهها، این امکان را فراهم مینماید تا ضمن تعیین موقعیت کروموزمی مکانهاي ژنی کنترل کننده - QTL - صفات از جمله ویژگیهاي تحمل به خشکی و بررسی دقیق ژنتیکی آنها، بعد از اعتبار سنجیQTL1 هاي بزرگ اثر و مقایسه با مطالعات دیگر، آن را جهت انتخاب به کمک نشانگر معرفی و کلون کردن توالیهاي DNA پیوسته جهت انتقال تحمل به خشکی و یا هرمی کردن مکانهاي ژنی موثر در تحمل از آن کمک گرفت.
همچنین با تطابق مکانهاي ژنی کنترل کننده صفات مختلف مطرح در این زمینه با هم و مقایسه آنها در شرایط تنش و بدون تنش، در رابطه با فهم مبانی بیولوژیکی ژنتیکی تحمل به خشکی یاري جست . - 3 - طی سالهاي اخیر کاربرد تجزیه QTL فرصت بینظیري در شناسایی نواحی کروموزمی کنترل کننده تنوع در صفات فیزیولوژیک، مورفولوژیک و فنولوژیک گیاهان در شرایط تنش خشکی را فراهم نموده است. به عنوان مثال، در گندم ویژگیهاي ریشهچه و ساقهچه - 4 - ، تداوم سبزي برگ، عملکرد و اجزاء آن در شرایط تنش - 5 - را میتوان نام برد. هدف از این پژوهش شناسایی مکانهاي ژنی کنترل کننده شاخصهاي مرتبط با تحمل خشکی در گندم نان در شرایط مزرعه است.
مواد و روشها
ارزیابی فنوتیپی طی آزمایشی در بهار سال زراعی 1388-89 در مزرعه دانشگاه شهرکرد انجام گردید . مواد ژنتیکی مورد استفاده در این آزمایش شامل دو لاین والدي CK و ES32 و 93 لاین دابلد هاپلوئید حاصل از تلاقی دو والد بود که از روش تلاقی با ذرت حاصل و همچنین از پنج رقم ایرانی به عنوان شاهد استفاده گردید. مواد ژنتیکی مذکور در در محیط تنش - عدم آبیاري از مرحله گلدهی - و بدون تنش ارزیابی و آزمایش در قالب طرح بلوك کاملا" تصادفی در سه تکرار در نظر گرفته شد. فاصله کشت بین و روي ردیف به ترتیب 20 و 2/5 سانیمتر در نظر گرفته شد. براي برآورد شاخصهاي حساسیت و یا تحمل به خشکی ژنوتیپ هاي مورد بررسی از رابطههاي پیشنهادي توسط فیشر و مورر - 1 - 2 استفاده شد و شاخصهاي مرتبط با تنش تحمل خشکی شامل TOL ، STI، SSI و GMP برآورد شدند.
DNA لازم براي آزمون نشانگرها براي ارزیابی لاینهاي جامعه و والدین آنها از برگهاي جوان و با استفاده از روش تغییر شکل یافته CTAB ارایه شده توسط - - 8 ، استخراج شد. در این بررسی با اعمال 30 جفت نشانگر ریزماهواره که توزیع مناسبی روي کروموزومها داشت استفاده گردید. به نحوي که میزان قابل قبولی از تراکم نشانگرها را در روي هر کروموزم در اختیار گذاشت.
تهیه نقشه لینکاژي نشانگرها، بعد از دستیابی به دادههاي نشانگرها در جامعه دابلد هاپلویید، آزمون کاي اسکور نسبت 1:1 باندهاي والدي روي آنها اعمال و پس حذف نشانگرهایی که از این نسبت انحراف نشان دادند، نقشه لینکاژي نشانگرها با استفاده ازتابع کازمبی، روش حداکثر درستنمایی، و با استفاده از نرم افزارهاي MAPMAKER و GMENDEL طبق روش ارایه شده در مقالات قبلی - 2 - تهیه شد.
تعیین ارتباط بین نقشه لینکاژي نشانگرها و شاخصها، با تجزیه QTL و استفاده از روش تجزیه تک نشانگر، صورت گرفت. در این بخش از تجزیه و تحلیل از نرمافزارهایی همانند MAPMAKER/QTL، SAS و MQTL کمک گرفته شد . به منظور مشاهده و تفکیک دقیقتر باندها از ژل پلیاکریل آمید توالییاب استفاده شد. این ژل قابلیت تفکیک قطعاتی که به اندازة یک نوکلئوتید با یکدیگر اختلاف دارند را دارا میباشد.
نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس جداگانه براي هر محیط و تجزیه مرکب دادهها نشان داد بین لاینهاي جامعه دابل هاپلوئید از لحاظ شاخصهاي تحمل اختلاف بسیار معنیداري - P<0/001 - وجود داشته است - دادهها آورده نشدهاند - ، که بیانگر تنوع ژنتیکی بین لاینهاي جامعه مورد مطالعه براي این صفت میباشد. میانگین امتیاز شاخص تحمل براي والدین و جامعه دابل هاپلوئید نشان میدهد رقم CK به عنوان یکی از والدین داراي مقادیر بالاتري از شاخصها در مقایسه با والد دیگر یعنی لاین ES32 بوده لذا نسبت به خشکی متحملتر میباشد. میزان شاخصهاي تحمل در لاینهاي جامعه دابلهاپلوئید در دو جهت افزایش و کاهش نسبت به والدین تفکیک متجاوز نشان دادند.
از شاخصهاي متعددي براي انتخاب ژنوتیپها در شرایط تنش استفاده میشود. براي تعیین بهترین شاخص تحمل، ضریب همبستگی بین این شاخصها و عملکرد دانه در شرایط تنش و بدون تنش محاسبه گردید - جدول. - 1 عملکرد دانه در هر دو شرایط تنش و بدون تنش با شاخصهاي MP، GMP و STI همبستگی مثبت و معنیدار - - P<0/001 نشان داد، لذا میتوان آنها را به عنوان شاخصهاي برتر معرفی نمود.
جدول .1 ضرائب همبستگی بین شاخصهاي تحمل به خشکی و عملکرد در دو محیط تنش و بدون تنش
تجزیه تک نشانگر براي تعیین QTLهاي کنترلکننده شاخصهاي تحمل به خشکی منجر به شناسایی برخی ژنهاي کنترلکننده براي تعدادي از این شاخصها از جمله TOL، YS و GMP گردید. نتایج این تجزیه نشان داد براي شاخص TOL یک QTL روي کروموزم1B،براي STI دو QTL روي کروموزمهاي 4A و 5A ، براي SSI دو QTL روي کروموزم2B، و براي GMP یک QTL روي کروموزم5A شناسایی گردید. در جدول - 2 - جایگاه هرکدام از آنها با LOD هر کدام مشخص گردیده است.
