بخشی از مقاله
چکیده
به طور کلی انتخاب روش برای تعیین غلظت پروتئینها وابسته به نوع و ماهیت پروتئین، ماهیت سایر ترکیبات نمونه پروتئینی، سرعت مورد لزوم، دقت و حساسیت آزمایش است. سادهترین روش اندازهگیری غلظت پروتئین در یک محلول، میزان جذب نور UV آن است. اگر پروتئین خالص باشد، غلظت آن را میتوان از روی OD به دست آمده، محاسبه کرد. اگر پروتئین خالص نباشد، مقدار جذب نوری، تنها امکان تخمین تقریبی غلظت پروتئین را فراهم میسازد. از مهمترین روشهای مورد استفاده برای تعیین پروتئینها میتوان روش بیوره نام برد. مکانیسم اندازه گیری پروتئین به روش بیوره تشکیل کمپلکس بین یونهای مس دو ظرفیتی - - Cu+2 و پیوندهای پپتیدی است و برای تشکیل کمپلکس نیاز به حداقل دو پیوند پپتیدی است تا کمپلکس تشکیل گردد که کمپلکس تشکیل شده رنگ آبی دارد.
جذب رنگ آبی تولید شده در طول موج 540 نانومتر ثبت میشود و از آنجایی که جذب با غلظت ارتباط مستقیم دارد رسم یک منحنی استاندارد مقادیر پروتئین مجهول در نمونه قابل اندازه گیری است. یکی از مهمترین روشها برای تعیین غلظت پروتئین در نمونهها، روش 2D Quant Kit میباشد که در آن بطور دقیق غلظت پروتئین مشخص میشود. در این روش پایه و اساس آن بر طبق روش بیوره و با ایجاد ترکیبات خاص یون مس با پروتئینها، میباشد. رنگی شدن محلول نهایی نشان از عدم ترکیب مس و کم بودن پروتئین در نمونه است و بین غلظت رنگ محلول نهایی و غلظت پروتئین همبستگی منفی وجود دارد. در مجموع در این مقاله سعی شده است نحوه تعیین غلظت پروتئین مورد بررسی قرار گیرد.
کلمات کلیدی: اسپکتروفتومتر، پروتئومیک، غلظت پروتئین، گیاهان
مقدمه
پروتئینها، دستهای بزرگ و ضروری از ماکروملکولهای سلولی را تشکیل میدهند. تعیین مقدار پروتئین نمونههای مختلف، در اغلب موارد، یکی از کارهای ضروری، پیش از جداسازی و خالصسازی نمونههای مختلف میباشد. این مرحله، یک مرحله ضروری قبل از ارائه نمونههای پروتئینی مختلف برای انجام کروماتوگرافی، الکتروفورز و تفکیک و آنالیزهای بیشتر ایمونو- شیمی میباشد. روشهای متفاوتی در تعیین غلظت محلولهای پروتئینی به کار گرفته میشوند که آنها را میتوان به دو دسته روشهای جذبی و رنگسنجی تقسیمبندی نمود .[6] هر یک از این روشها دارای مزایا و محدودیتهایی بوده و هیچ کدام دارای دقت صددرصد نمیباشند. هر یک از این روشها فقط حضور قسمت خاصی مثلاً یک اسید آمینه خاص را از محلول پروتئینی تشخیص میدهند. از آنجائی که حضور و فراوانیاین قسمتها در پروتئینهای مختلف با یکدیگر فرق می کند، برای رفع این مشکل و افزایش دقت بایستی روش مناسبی را انتخاب نمود.
در تمامی این روشها از اسپکتروفتومتر استفاده میشود. سادهترین روش اندازه گیری غلظت پروتئین در یک محلول، میزان جذب نور UV آن است .[3] اگر پروتئین خالص باشد، غلظت آن را میتوان از روی OD به دست آمده، محاسبه کرد. اگر پروتئین خالص نباشد، مقدار جذب نوری، تنها امکان تخمین تقریبی غلظت پروتئین را فراهم میسازد. این روش برای مقادیر کم پروتئین - 0.05-0. 1 mg/ml - در محلولی که حاوی سایر مواد جاذب اشعه UV نظیر بعضی بافرها، اسیدهای نوکلئیک و بعضی لیپیدها و یا محلول های سوسپانسیون باشد، مناسب نیست. روشهای رنگ سنجی، پیچیدهتر بوده، اما حساستر میباشند و برای پروتئینهایی که به صورت سوسپانسیون هستند، نیز مناسب است. روشهای بسیاری برای تعیین غلظت پروتئینها وجود دارند. معیارهایی که برای ارزیابی روش مناسب به کار میروند، شامل حساسیت کافی، صحت و قابلیت تکرارپذیری میباشد. رایجترین روش برای تعیین اندازهگیری غلظت پروتئینها در آزمایشگاههای بیوشیمی پیشرفته احتمالا روش لوری و - یا - برادفورد است.[8]
انتخاب روش اندازهگیری مناسب پروتئینها
اندازهگیری پروتئین، به منظور بررسی حضور پروتئین در نمونه به کار می رود. این نوع آزمایشها بر پایه توانایی اتصال اختصاصی رنگ به پروتئین حتی در مخلوطهای کمپلکس مانند شیر یا هموژنیت سلول استوارند. برخی روشهای اندازهگیری پروتئین ها، کیفی بوده و فقط حضور و یا عدم حضور پروتئین را در نمونه نشان میدهند. روشهای اندازهگیری کمی پروتئینها از قبیل بیوره، لوری، برادفورد و … توانایی تشخیص مقادیر مختلف پروتئین در نمونه را دارا می باشند - جدول . - 1 محققین ممکن است از اطلاعات و ویژگیهای روش اندازهگیری پروتئین در ترکیب با سایر آزمایشها برای نتیجه یا فعالیت اختصاصی یک دارو که به عنوان یک پروتئین یا داروی حاوی پروتئین عمل مینماید، استفاده کنند.[1] اگر نمونهها حاوی عوامل احیا کننده یا معرف های شلاته کننده مس باشند، روش کوماسی بلو، روش انتخابی میباشد.
چنانچه نمونه های مورد نظر برای آنالیز، حاوی یک یا چند دترجنت - تا غلظت 5 درصد - باشند، روش انتخابی، روش BCA - Bbicinchoninic acid assay - میباشد. گاهی اوقات نمونهها حاوی موادی هستند که آنها را برای اندازهگیری با هر روشی نامناسب میسازد. روش ارجح در این گونه موارد، خارج کردن ماده مزاحم با روشهایی از قبیل دیالیز، نمکزدایی - - Desalting، بلوکه سازی شیمیایی - Chemical Blocking - و رسوب پروتئین و محلولسازی مجدد آن - Resolubilization - میباشد. بلوکه سازی شیمی، شامل تیمار نمونه با موادی است که مانع تداخل مواد مزاحم با روش مورد نظر برای اندازهگیری میشوند. رسوب پروتئینها موجب خارج شدن آنها از محلول میشود. در این هنگام، بافر تداخل کننده، خارج شده و پروتئین مجددا محلول میگردد. در روش تیمار شیمی، که در روش BCA کاربرد دارد، برخلاف روش رسوب پروتئینها، محلول کردن مجدد پروتئینهای هیدروفوب انجام نمیشود .[2]
ویژگیهای کلی اندازه گیریهای بیوشیمیایی
محدوده پاسخ دینامیک و حساسیت
همه روشهای اندازه گیری دارای محدوده پاسخ دینامیک میباشند. محدوده پاسخ دینامیک عبارت است از محدودهای که غلظتهای نمونه در آن، ایجاد پاسخهای افتراقی نمایند.در شکل 1، روش اندازه گیری B - منحنی - B نشان دهنده توانایی ایجاد پاسخهای افتراقی در محدوده مقادیر وسیعتری میباشد؛ در حالیکه، روش اندازهگیری A - منحنی - A، غلظتهای پایینتر پروتئین را که با روش B نمیتوان آنها را اندازه گیری کرد، نشان میدهد. در اینجا می گوییم که حساسیت روش A، بیشتر از روش B میباشد. در نتیجه، روش A ممکن است در مواردی که غلظت پروتئین نمونه پایین است، روش انتخابی باشد. نمونههای دارای غلظت بالای پروتئین را میتوان به وسیله رقیق کردن با این روش - روش - A انجام داد.
اختصاصیت و بازیافت نمونه
یک روش اندازهگیری اختصاصی تنها با ماده مورد اندازهگیری و نه هر گونه ماده دیگر، واکنش میدهد. هر گونه ماده دیگری که تولید پاسخهای مشابه با ماده مورد نظر برای اندازه گیری نماید، ماده ]تداخل کننده یا مداخلهگر[ نامیده میشود. روشهای اندازهگیری بسیار کمی، 100 درصد اختصاصی عمل کرده و اکثر روشها، به برخی مواد مداخله گر پاسخ می دهند. یک محقق کارآزموده می داند که چه موادی با روش اندازهگیری تداخل ایجاد کرده و چه مواد مداخلهگری احتمالا در نمونه حضور دارند. در برخی موارد، مقدار نمونه موجود، بسیار محدود و کم میباشد. در این گونه موارد لازم است که برای کارهای بعدی، نمونه پروتئین را از روش اندازهگیری بازیافت نماییم. برای این کار لازم است روشی را انتخاب کنیم که ساختمان پروتئین را تخریب ننماید.
مقرون به صرفه بودن و ایمنی
یکی از کارهای ضروری برای انتخاب هر روشی، مقرون به صرفه بودن و در دسترس بودن مواد مورد نیاز برای آن روش میباشد. شما باید هزینه تجهیزات، معرفهای شیمیایی و ساعت کاری پرسنل را برای تهیه و ساخت معرفها و مواد شیمیایی و انجام آزمایش را مد نظر قرار دهید. روشی را که بر میگزینم باید تا حد امکان دارای کمترین احتمال خطر برای پرسنل و محیط زیست و طبیعت باشد .[4]
