بخشی از مقاله
چکیده
پاپاور براکته آتوم - Papaver bracteatum - یکی از گیاهان دارویی ارزشمند است که در شیرابه خود حاوي مقدار قابل توجهی آلکالوئید تبائین میباشد.تبائین به سادگی با استفاده از واکنش دمتیلاسیون به کدئین تبدیل می گردد که تاثیر آن براي کاهش درد و سرفه شناخته شده است با توجه به اینکه تا کنون مطالعهاي بر روي پپتیدهاي گیاه پاپاور براکته آتوم انجام نگرفته است، لزوم مطالعه پروتئینی در این گونه حائز اهمیت میباشد. نظر به محدودیت اطلاعات در خصوص استخراج و رنگ آمیزي پروتئین در این گونه، مطالعه حاضر با هدف بررسی بهترین روش استخراج و رنگ آمیزي پروتئین در 18جمعیت از گیاه پاپاور براکته آتوم انجام شد.
بر اساس نتایج به دست آمده براي استخراج پروتئین از بین سه روش فنول، تریس، فسفات و تري کلرو اسید استیک در این گونه، روش فنول بهترین نتیجه را نشان داد. در آزمایش حاضر نسبت به مقایسه روش هاي مختلف رنگ آمیزي روش کوماسی بریلیانت بلو آر 250، روش نیترات نقره و روش کوماسی بریلیانت بلو جی 250 از نظر ظاهر سازي باندهی پروتئینی اقدام گردید.و رنگ آمیزي با استفاده از کوماسی برلیانت بلو 250G بهترین نتایج را نشان دادند.
مقدمه
جنس پاپاور متعلق به خانواده Papaveracea است که داراي 44 گونه مختلف میباشد - صدیق و همکاران، . - 1982 عادت رشدي این گیاهان به صورت یکساله تا چندساله است وگل دهی گیاه در اواسط تابستان اتفاق میافتد گلهاي گیاه داراي رنگ قرمز و مخملی است.گیاه پاپاور براکته اتوم به طور معمول در چند منطقه در شرق آسیا به طور وحشی رشد میکند از این مناطق میتوان به مناطق شمالی ایران بالاخص کوههاي البرز و همچنین شمال غرب و غرب ایران اشاره کرد. این گیاه در مناطقی به جز ایران مانند کوههاي قفقاز و قسمتی از روسیه با تراکم کمتر رشد میکند. پاپاور براکته اتوم یکی از گیاهان با ارزش دارویی است که در شیرابه خود داراي مقدار قابل توجهی آلکالوئید تبائین میباشد. تبائین میتواند به سادگی با استفاده از یک واکنش دمتیلاسیون به کدئین تبدیل گردد
کدئین یکی از مهمترین آلکالوئیدهاي داروئی است که تاثیر آن براي کاهش درد و سرفه شناخته شده است
از میان گیاهان جنس پاپاور، گیاه Papaver bracteatum L. از گیاهان وحشی و داروئی بوده که با وجود اینکه گیاهی بومی و خاص ایران است تاکنون هیچ مطالعه ملکولی و پروتئینی روي آن انجام نگرفته است. باتوجه به این که کیفیت و کمیت پروتئین استخراج شده تاثیر بسیار زیادي در بررسیهاي پروتئینی و مولکولی دارد و از طرف دیگر اطلاعات محدودي در خصوص استخراج و رنگ آمیزي پروتئین در این گونه مورد نظر موجود است، لذا در این پژوهش روشهاي مختلف استخراج پروتئین و رنگ آمیزي مورد بررسی قرار گرفت تا بهترین روش استخراج و رنگ آمیري پروتئین براي این گونه معرفی شود.
مواد و روشها روشهاي مورد استفاده به منظور بهینه سازي استخراج کل پروتئینهاي بذري در تحقیق حاضر، بذور 18 ژنوتیپ شقایق سرخ ایران مورد استفاده قرار گرفت.
الف- روش تریس
یک میلی لیتر بافر استخراج تریس به میکروتیوبهاي حاوي پروتئینهاي بذري اضافه شد و نگهداري نمونهها در دماي 4 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت انجام شد. نمونهها به مدت 15 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی حاصل به میکروتیوب جدید انتقال یافت.
ب- روش فسفات
به میزان 15000 میکرولیتر بافر استخراج فسفات به میکروتیوبهاي حاوي پروتئینهاي بذري افزوده شد و نمونهها با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت سه دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول رویی حاصل به میکروتیوب جدید انتقال یافت و سانتریفیوژ محلول به مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه انجام شد. یک میلیلیتر بافر استخراج تازه به رسوب حاصل از مرحله پیشین اضافه شد و سانتریفیوژ کردن نمونهها با سرعت 7000 دور در دقیقه به مدت سه دقیقه انجام و در نهایت محلول رویی به میکروتیوب جدید انتقال یافت.
ج- روش تري کلرو اسید استیک
مقدار یک میلیلیتر بافر استخراج تري کلرو اسید استیک به میکروتیوبهاي حاوي پروتئین اضافه و سانتریفیوژ کردن نمونهها با سرعت 5000 دور در دقیقه در دماي 4 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انجام شد. محلول رویی به میکروتیوب جدید منتقل و چهار برابر حجم آن بافر رسوبدهی به منظور رسوب پروتئینها افزود شد. نمونهها در دماي -20 درجه سانتیگراد به مدت حداقل یک ساعت نگهداري شدند. سانتریفیوژ نمونهها با سرعت 15000 دور در دقیقه در دماي چهار درجه سانتیگراد به مدت 45 دقیقه انجام شد.
پلیتهاي حاصل در 3 بازه زمانی با محلول شستشو، شستشو شدند. سانتریفیوژ پلیتهاي حاوي محلول شستشو با سرعت 15000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه انجام شد و در نهایت محلول رویی حاصل دور ریخته شد و پلیتها در دماي اتاق خشک شدند.
د- روش فنل
پروتئینهاي استخراج شده به سرعت درون میکروتیوبهاي 1/5 میلیلیتر حاوي 300 میکرولیتر بافر استخراج 100 - میلیمولار تریس اچ-سی-ال، 10 میلیمولار دي سدیم اتیلن ديآمینتترا اسیداستیک، 0/9 میلیمولار ساکارز و %0/5 حجمی به حجمی بتا-مرکاپتواتانول - منتقل شدند. به میزان300 میکرولیتر فنول اشباع شده توسط تریس اچ- سی-ال با اسیدیته 8/8 به میکروتیوب حاوي ترکیب پروتئین و بافر استخراج اضافه شد و میکروتیوبها روي دستگاه همزن مغناطیسی با سرعت 160 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه روي یخ قرار گرفتند. نمونهها با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند.
محلول رویی بدست آمده از مرحله پیشین به میکروتیوب جدید انتقال و پنج برابر حجم آن بافر رسوبدهی افزوده شد و میکروتیوب در دماي -20 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت قرار گرفتند. نمونهها با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شده و محلول رویی حاصل شده از مرحله پیشین دور ریخته شد و رسوب با 1 میلی لیتر بافر شستشو شسته شد.
میکروتیوبها در دماي -20 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند. نمونهها با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول رویی دور ریخته شد و رسوب با 1 میلی لیتر اتانول 70 درصد شسته و در دماي -20 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه نگهداري شد. نمونهها با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته شد و رسوب پروتئین خالص خشک شد. سپس 30 میکرولیتر بافر نمونه به رسوب پروتئین افزوده شد و رسوب در آن حل و در دماي -20 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
تعیین غلظت پروتئینهاي استخراجی
پس از استخراج پروتئین، غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد و پروتئینهاي استاندارد سرم آلبومین گاوي تعیین شد
محلولهاي پروتئین استاندارد در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده شد و میزان جذب نور توسط دستگاه با طول موج 595 نانومتر قرائت شد. براي هر نمونه یک استاندارد ثبت و با استفاده از غلظت پروتئینهاي مشخص شده خط رگرسیون ترسیم گردید. سپس منحنی استاندارد با رسم مقادیر خوانده شده توسط دستگاه در مقابل غلظتهاي معلوم آنها رسم گردید. پس از آن معنی دار بودن ضریب رگرسیون و عرض از مبدأ این خط نیز مورد آزمون قرار گرفت. پس از مشخص شدن معادله نهایی خط، غلظت پروتئین درنمونههاي مورد بررسی تعیین شد
20 میلیگرم از پودر سرم آلبومین گاوي توسط ترازوي با دقت 0/001 گرم توزین و در 20 میلیلیتر آب مقطر استریل حل گردید و محلول استاندارد سرم آلبومین گاوي تهیه شد. بدین ترتیب هر یک میکرولیتر از محلول استاندارد سرم آلبومین گاوي حاوي یک میکروگرم پروتئین بود. از آنجا که ماده رنگی سرم آلبومین گاوي به طور قوي با کووتهاي کوارتزي متصل میگردد بنابراین از کووتهاي شیشهاي 500 میکرولیتري استفاده شد. در هر حال پس از هر بار استفاده از کووتها و اندازه گیري جذب هر نمونه، کووتها با اتانول و سپس آب مقطر شستشو و خشک گردید
مراحل تعیین غلظت پروتئینهاي استخراجی به روش برادفورد به شرح ذیل انجام گردید:
- تهیه استوك سرم آلبومین گاوي 40 میلی گرم/میلی لیتر از سرم آلبومین گاوي جامد با استفاده از آب مقطر
- تهیه استوك سرم آلبومین گاوي 4 میلی گرم/میلی لیتر از استوك 40 میلیگرم/میلیلیتر با استفاده از آب مقطر
