بخشی از مقاله
چکیده:
سنجش دقیق میزان پروتئﲔ در فرایند تولید پروتئﲔ هاي نوترکیب از اﳘیت بسزایی برخوردار است. شناخت دقیق ماهیت پروتئﲔ و ترکیب بافري1 آن ، دو رکن اساسی در بکارگﲑي اسﱰاتژي مناسب جهت تعیﲔ غلظت پروتئﲔ است. بنابراین بکارگﲑي روش هایی که سازگاري بیشﱰي با ماهیت پروتئﲔ و ترکیب بافري داشته باشد از اولویت خاصی برخوردار است. در این مطالعه، روشQuantitative SDS-PAGE جهت سنجش میزان پروتئﲔ اسﱰپتوکیناز نوترکیب2 طراحی شد و ﳏدودیت هاي تست 3BCA مورد بررسی قرارگرفت. وجود عوامل احیا کننده که در فرایند واسرشتگی4و تاخوردگی ﳎدد5پروتئﲔهاي نوترکیب بکار می روند، فاکتور اصلی در ﳏدودیت روش هاي معمول سنجش پروتئﲔ - نظﲑ - BCA می باشد. نتایج این بررسی نشان می دهد که در آنالیزهاي کنﱰل کیفی حﲔ تولید،روش Quantitative SDS-PAGE می تواند ضمن تعیﲔ درجه خلوص، سنجش دقیقی از میزان پروتئﲔ هدف را فراهم ﳕاید.
کلمات کلیدي: سنجش پروتئﲔ، اسﱰپتوکیناز نوترکیب، Quantitative SDS-PAGE ، .BCA
مقدمه :
با توجه به اینکه سنجش دقیق میزان پروتئﲔ مبناي اﳒام سایر ﳏاسبات نظﲑ تعیﲔ میزان فعالیت پروتئﲔ است از اﳘیت خاصی برخوردار می باشد. در فرایند تولید پروتئﲔ هاي نوترکیب، این میزان با روش هاي معمول سنجش پروتئﲔ نظﲑ لوري6 ، برادفورد7 و BCA تعیﲔ می شود. روش هاي مذکور بر اساس ماهیت پروتئﲔ مورد سنجش، ترکیب بافري مربوطه و مکانیزم عمل واکنش گرها8 عمل می کنند . - 1 - با این وجود در آنالیزهاي کنﱰل کیفی ﳏصولات نوترکیب، روشهاي ذکر شده با ﳏدودیت هاي چندي مواجه است. علاوه بر آن در آنالیزهاي مربوط به کنﱰل حﲔ تولید، حضور عوامل تداخل گر ﳑکن است باعث شود که سنجش صحیحی از میزان تولید پروتئﲔ هدف بدست نیاید.
بر این اساس لزوم طراحی روشی که بتواند بدون اثرپذیري از ماهیت پروتئﲔ هدف و سایر عوامل پﲑامونی، سنجش صحیحی از میزان پروتئﲔ بدست بدهد ضروري به نظر می رسد. اخﲑاٌ گزارشاتی در خصوص استفاده از روش""Quantitative SDS-PAGE جهت سنجش میزان پروتئﲔ ارائه شده است. در بررسی اخﲑ، این تکنیک متناسب با اقتضائات پروسه تولید پروتئﲔ 2r-SK طراحی شده که به وسیله این روش جدید می توان ضمن تعیﲔ درجه خلوص ، سنجش دقیقی از میزان پروتئﲔ هدف را نیز بدست آورد 4 - ،3،. - 2
مواد و روش ها:
سنجش مقدار پروتئﲔ به دو روش "BCA" و" " Quantitative SDS-PAGE با استفاده از آلبومﲔ سرم گاوي 9 به عنوان پروتئﲔ استاندارد با غلظت - Pierce, USA - 2mg/ml صورت گرفت . ﳕونه پروتئیﲏ مورد آزمایش اسﱰپتوکیناز نوترکیب - r-SK - تولید شرکت کارخاﳒات داروپخش می باشد که غلظت آن در طی مراحل ﲣلیص، قبل و بعد از مرحله ﳕک زدایی با استفاده از روش هاي مذکور تعیﲔ و مقایسه گردید.
-1 سنجش پروتئﲔ با استفاده از کیت :
BCA شد. از ﳏلول این سنجش با استفاده از کیت - Pierce, USA - BCA اﳒام استوک BSA با غلظت 2 mg/ml ﳏلول هایی با غلظت هاي 125،250،500
و1000 میکروگرم در میلی لیﱰ ﲥیه شد و پروتئﲔ r-SK مورد آزمایش در ﳏدوده غلظت استانداردها رقیق شد . پس از ﲥیه واکنش گرها طبق روش ارائه شده در کیت - - 5 و اضافه کردن آن به لوله هاي ﳏتوي استاندارد و ﳕونه ها، لوله ها به مدت 30 دقیقه در ﲪام 37°C قرارداده شد، سپس جذب ﳏلول هر لوله درطول موج 562 nm - UV/Vis Spectrophotometer Perkin Elmer, USA - اندازه گﲑي شد. با استفاده از منحﲏ استاندارد غلظت پروتئﲔ r-SK تعیﲔ شد.
-2 سنجش پروتئﲔ با استفاده از روش : Quantitative SDS-PAGE
مواد شیمیایی و ﳏلول هاي مورد استفاده با درجه خلوص بالا1 از شرکتهاي Merck و Pharmacia ﲥیه شده اند. SDS-PAGE با استفاده از سیستم - Mini-Protean 3cell, Bio-Rad, USA - طبق روش لاملی2 و با ژل پلی آکریل آمید % 12/5 و رنگ آمیزي با کوماسی آبی R-250 3 اﳒام شد . - 6 - از ﳏلول استوک BSA با غلظت 2mg/ml ﳏلول هایی با غلظت هاي 125،250،500 و1000 میکروگرم در میلی لیﱰ ﲥیه شد. پروتئﲔ r-SK مورد آزمایش در ﳏدوده غلظت استانداردها رقیق گردید و سپس ﳕونه ها به نسبت 1:1 با بافر ﳕونه ﳐلوط و به مدت 5 دقیقه در ﲪام آب جوش قرار داده شد . - 7 - پس از سانﱰیفوژ در 12000rpm به مدت 5 دقیقه، 15 میکرولیﱰ از هریک از ﳕونه ها به چاهک هاي ژل اضافه و جریان الکﱰیکی با ول تاژ ثابت 100 ولت برقرار شد. پس از پایان الکﱰوفورز، ژل با کوماسی آبی R-250 رنگ آمیزي - - 8 و پس از دنسیتومﱰي با نرم افزار TotalLab، غلظت r-SK تعیﲔ گردید.
نتایج و ﲝث:
بر اساس نتایج تست تعیﲔ مقدار پروتئﲔ با روش BCA چنﲔ استنباط می شود که بازده مرحله ﳕک زدایی حدود %20 است، در صورتیکه دنسیتومﱰي باند حاصل از SDS-PAGE - شکل- - 1، چنﲔ نتیجه اي را تایید ﳕی کند . با توجه به اینکه مرحله ﳕک زدایی صرفاً به منظور حذف ﳕک اﳒام می شود انتظار بر این است که تغیﲑ فاحشی در غلظت پروتئﲔ مشاهده نشود. چنﲔ به نظر می رسد که عامل اصلی تداخل در سنجش پروتئﲔ به روش BCA، حضور عوامل احیا کننده ایست که در فرایند واسرشتگی و تاخوردگی ﳎدد پروتئﲔ هاي نوترکیب بکار می روند.نتایج بدست آمده از Quantitative SDS-PAGE - شکل- - 1 نشان می دهد که بازده مرحله ﳕک زدایی حدود %77 است - جدول-. - 1 این نتایج مؤید کروماتوگرام حاصل از مرحله ﳕک زدایی و بازده مورد انتظار آن است.
با توجه به اینکه در فرایند ﲣلیص پروتئﲔ هاي نو ترکیب تکنیکSDS-PAGE رایج ترین روش جهت تعیﲔ درجه خلوص و بازده هر مرحله می باشد، بکارگﲑي تکنیک Quantitative SDS-PAGE بااستفاده از یک پروتئﲔ استاندارد با غلظت معﲔ، ضمن تعیﲔ درجه خلوص، سنجش دقیقی از میزان پروتئﲔ هدف را فراهم می ﳕاید. ﳘچنﲔ این روش در مقایسه با سایر روش هاي سنجش پروتئﲔ تاثﲑپذیري کمﱰي نسبت به عوامل تداخل گر دارد.
