بخشی از مقاله
چکیده:
در سالهای اخیر روش های زیست فن آوری در علوم زراعی برای افزایش محصولات گیاهی و تولید گونه های جدید گیاهان دستکاری شده به کار میرود و این گیاهان در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی، داروسازی، محیط زیست و .... کاربرد یافته اند. فناوری تولید محصولات دستکاری شده ژنتیکی یا تراریخته از جمله فناوری های مهم و پیشرفته دنیا محسوب می شود که مورد استقبال و توجه ویژه کشورهای بسیار پیشرفته مانند ژاپن، استرالیا، آلمان، فرانسه و اسپانیا و حتی کشورهایی مانند هندوستان، چین، فیلیپین و برخی کشورهای آفریقایی مانند بورکینافاسو و میانمار می باشد. در حال حاضر در 29 کشور دنیا بیش از 50 هزار هکتار سطح زیر کشت محصولات تراریخته ایجاد شده است، به نحوی که تنها در سال 1389 یا 2010 میلادی، 148 میلیون هکتار سطح زیرکشت گیاهان به تولید محصولات تراریخته اختصاص پیدا کرد و هم اکنون بیش از 200 کشور دنیا از جمله ایران مصرف کننده این محصولات تراریخته هستند.
مزایایی همچون افزایش راندمان، مقاومت در برابر عوامل نامساعد - نظیر خشکی، آفات و ... - و کیفیت بالا سبب اهمیت روز افزون محصولات GMO گردیده است. از آنجا که تاثیرات سوء احتمالی این محصولات بر اندام های انسانی، محیط زیست و اکوسیستم طبیعی زمین هنوز کاملا مشخص نیست، یافتن روشهای آنالیز و ردیابی محصولات GMO به منظور الزام و اجبار رعایت قوانین برچسب گذاری آنها ضروری می باشد تا مصرف کننده با آگاهی از خطرات احتمالی این محصولات اقدام به انتخاب یا عدم انتخاب این فراورده ها نماید. در این مطالعه سعی بر آن است تا روش های شناسایی و ردیابی محصولات GMO معرفی شود تا شاید راهنمایی برای دست اندرکاران امر کنترل کیفیت محصولات گیاهی وارداتی به کشور بوده و بتواند گامی در جهت حفظ ایمنی و حقوق مصرف کنندگان باشد.
واژه های کلیدی: تراریخته، دستکاری ژنتیکی، ژن، بلاتینگ، کروماتوگرافی
مقدمه
از آنجا که در حال حاضر بیش از یکصد محصول اصلاح شده ژنتیکی - GMO - تولید شده و در سطح جهان بطور تجاری عرضه می شود، یافتن روشهای آنالیز و ردیابی GMO به منظور الزام و اجبار رعایت قوانین برچسب گذاری GMO ها ضروری می باشند. امروزه میلیون ها هکتار زمین در جهان زیرکشت گیاهان ترانس ژنیک قرار دارد و گیاهانی مانند سویا، پنبه، برنج و گندم با روش ترانس ژنیک دستکاری شده اند تا محصول آنها افزایش یابد. علاوه بر افزایش محصول، دلایل دیگری هم برای دستکاری ژنتیکی وجود دارد. از جمله گیاهان را به شوری و خشکی مقاوم می کنند تا آنها را در زمینهای شور و خشک پرورش دهند. با استفاده از این روش، گیاهان را می توان نسبت به عوامل زیستی نامساعد مقاوم ساخته و گیاهانی را تولید کرد که در مقابل حشرات، باکتری ها، ویروس ها، قارچ ها و آفات زیستی مقاوم هستند.
تولید گیاهان تراریخته نیاز به سم پاشی و استفاده از سموم شیمیایی را کاهش می دهد و از این طریق به حفظ محیط زیست کمک می کند، اما تاثیرات سوء احتمالی آنها بر اندام های انسان و سایر مزارع طبیعی مجاور آنها، هنوز کاملا مشخص نیست. هم اکنون محصولات تراریخته در 29 کشور جهان کشت می شود، به عنوان مثال بیش از 70 درصد سویای مصرفی در دنیا سویای تراریخته است که از کیفیت بسیار بالایی برخوردار است و این محصول علاوه بر محصولات دیگر تراریخته، در بیش از 200 کشور دنیا به مصرف می رسد. در کشور ما نهادی تحت عنوان "شورای ایمنی زیست" که به تازگی قانون آن تصویب شده است با تشکیل دبیرخانه ای در سازمان حفاظت محیط زیست، مسئولیت تولید و عرضه محصولات تراریخته در ایران بر عهده گرفته است.
هشت نوع محصول تراریخته - دستکاری ژنتیکی شده - در کشور تولید شده است که فعلا هیچکدام اجازه عرضه در بازار را ندارند. با این وجود کنترلی بر محصولات وارداتی به کشور وجود ندارد. طبق بررسی های انجام شده توسط موسسه تحقیقات برنج متاسفانه برنج های هندی وارداتی با توجه به ویژگی های غیر معمول و غیر طبیعی که دارند مشکوک به دستکاری ژنتیکی هستند و مصرف آن ها می تواند منجر به بروز مشکلات گوارشی و سایر مشکلات برای سلامت انسان شود. آن چه به طور غیررسمی در این خصوص مطرح شده است، آلوده بودن این برنج ها به ماده شیمیایی »فنول« است که به شدت سرطان زاست. ضمن آن که موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی نیز به عنوان اصلی ترین و مهم ترین مرجعی که در این زمینه می تواند اظهارنظر کند تنها نسبت به آلودگی شیمیایی این برنج ها هشدار داده است .
امروزه برای شناسایی و ردیابی محصولات اصلاح شده ژنتیکی، روشهای ردیابی مبتنی بر DNA و مبتنی بر پروتئین در تحقیقات مختلف مورد بررسی قرار گرفته اند. تغییری که سبب می شود یک محصول GM شود اغلب بصورت انتقال یک قطعه از DNA به ژنوم ارگانیسم است که قطعه DNAوارد شده اصطلاحا insert نامیده می شود. برای شناسایی محصول GM باید insert ردیابی شود. بدین منظور در روشهای مختلف یا ژن های تغییر یافته هدف یعنی DNA و یا محصولات ژن یعنی RNA و پروتئین مورد ردیابی و شناسایی قرار می گیرند. در حال حاضر بیشتر روشهای بر پایه DNAبرای ردیابی محصولات تغییر یافته ژنتیکی مورد استفاده قرار می گیرند زیرا DNA مولکول نسبتا پایداری است. معمولترین روش شناسایی نیز روش PCR است که بسیار حساس و دقیق می باشد. محدودیت روش PCR آنست که برای انجام هر نوع ردیابی مبتنی بر PCR باید اطلاعات مربوط به توالی DNA وارد شده - insert - را در اختیار داشت تا بتوان پرایمر الیگونوکلئوتیدی مناسب آن را طراحی و انتخاب نمود. بنابراین PCR روش مناسبی برای ردیابی مستقیم محصولات GMO ناشناخته نمی تواند باشد .با توجه به توسعه سریع گیاهان GM که دارای ژن های مخلوط، جدید و ناشناخته می باشند محققان لزوم دستیابی به تکنولوژی های نوین و ابزارهای جایگزین برای ردیابی insert های ناشناخته را احساس می کنند. از این رو در مطالعات مختلف کاربرد روش های متفاوتی جهت ردیابی محصولات GM مورد بررسی قرار گرفته است که مهمترین آنها شامل:
-روشهای کروماتوگرافی
-اسپکتروسکوپی نزدیک مادون قرمز - - NIR -میکرواری - ریزآرایه - و میکرو چیپ -تکنیک بلاتینگ
-تکنیک پلی مورفیسم طول قطعات تکثیر شده - AFLP - می باشند که در زیر به تفکیک مورد بحث قرار می گیرند.
-1 روش های کروماتوگرافی
زمانی که ترکیب اجزای یک محصول GMO مانند محتوی اسیدهای چرب یا تری گلیسیریدهای آن تغییر کند، روش های شیمیایی متداول بر پایه کروماتوگرافی می تواند برای ردیابی تفاوت های ایجاد شده در ترکیب شیمیایی مورد استفاده قرار گیرد .بردول و نف - 1996 - روغن حاصل از کانولای GM را با روش کروماتوگرافی با کارایی بالا - HPLC - تلفیق شده با اسپکترومتری جرمی-یونیزاسیون شیمیایی فشار اتمسفری - APCI-MS - مورد بررسی قرار دادند. در این روش شناسایی بر اساس قطعات دی آسیل گلیسرول و نیز یونهای تری گلیسیرید پروتونه شده بود. تعیین مقدار کمی یونها توسط دتکتور یونیزاسیون شعله ای - FID - انجام شد. این محققان در بررسی الگوی تری گلیسیریدی نمونه ها دریافتند که در روغن واریته های GM کانولا، مقدار تری آسیل گلیسرول ها افزایش یافته است که نشان دهنده پایداری اکسیداتیو بیشتر برای روغن کانولای حاوی اسید استئاریک بالا و نیز برای روغن کانولای حاوی اسید لوریک بالا می باشد.
این نتایج، مطالعات قبلی بر2 روی پایداری اکسیداتیو روغن واریته های جدید سویا و روغن کانولای حاوی اسید اولئیک بالا که توسط نیف و همکاران به روش HPLC-FID بدست آمده بود را تایید می کرد. این روش تنها زمانی کاربرد خواهد داشت که تغییر مهمی در ترکیب گیاهان GM یا محصولات آنها ایجاد شده باشد از این رو مخلوط شدن مقادیر اندک از روغن کانولای GM با ترکیب تری گلیسیریدی تغییر یافته را در روغن کانولای معمولی نمی توان با روش فوق تشخیص داد . همچنین تفاوت های طبیعی الگوی ترکیبات را در واریته های مختلف گیاهان باید مد نظر قرار داد.
-2 اسپکتروسکوپی نزدیک مادون قرمز برخی از تغییرات ژنتیکی خاص ممکن است ساختار فیبری در گیاهان را تغییر دهد در حالیکه تغییر چشمگیری در محتوی پروتئین یا اسید چرب محصول ایجاد نکند مانند سویای GM - سویای . - RR این موارد را می توان بوسیله اسپکتروسکوپی نزدیک مادون قرمز - NIR - ردیابی نمود - هربرگ و همکاران . - 2000 لازم به ذکر است روش NIR هم مانند روش کروماتوگرافی قادر به تشخیص مقادیر اندک واریته های GM مخلوط شده با محصولات غیر GMنیست.
-3تکنولوژی ریزآرایه ها - میکرو اری -
یکی از چالش هایی که ارزیابان محصولات GMO در آینده نزدیک با آن روبرو خواهند شد، توسعه سریع گیاهان GM است که دارای ویژگیهای جدید و عوامل کنترل ژنی مختلف و متعدد می باشند. به عنوان مثال همر - 1997 - گزارش کرد که برخی محصولات GM تصویب شده نه حاوی پروموتور s 35 و نه ترمیناتور می باشند - این توالی ها معمولا در روش های تشخیص محصولات GM مورد ردیابی قرار می گیرند - که این امر تشخیص آنها را با روشهای متداول مشکل می سازد. با وجود آنکه ثبت ژن ها و استفاده از سیستم های بیوانفورماتیک پیشرفته می تواند در فراهم آوردن اطلاعات ابتدایی درباره انواع اصلاحات ژنتیکی ممکن مفید و موثر باشد، تکنولوژی های جدید و ابزارهایی مورد نیاز خواهند بود که عملکرد ردیابی بالا و هزینه پایین داشته باشند. به نظر می رسد تکنولوژی های جدید بدست آمده از تلفیق میکروسیستم های بر پایه چیپ نظیر میکرواری - ریزآرایه - می تواند در کاربردهای آنالیز GMO در آینده بسیار کارا و موثر باشد.
مارک شنا، پدر تکنولوژی ریزآرایه ها، اولین مقاله خود در رابطه با ریز آرایه ها را در سال 1995 منتشر کرد. اولین داده های مربوط به ریزآرایه های انسانی نیز در همان سال ارائه گردید. این آرایه ها موجب بهبود هیبریدیزاسیون اختصاصی DNA شده و روش آنالیز نوینی را برای پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک، ژن ها و سایر مولکول های زیستی در مقیاس ژنوم فراهم می آورند. تا چندی پیش بحث در زمینه تولید آرایه ها به مقیاس میکرو محدود بود اما با پیشرفت امکانات و دستیابی به روش های نوین، این بحث وارد فاز نانو گردیده است.
آرایه به صورت مجموعه ای از نقاط منظم تعریف می شود که هر نقطه حاوی یک گونه مشخص از اسیدهای نوکلئیک تک رشته ای می باشد. تکنیک ریز آرایه ها بر ویژگی هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک استوار است بطوریکه توالی های مولکول های اسید نوکلئیک تک رشته که بر روی یک زمینه تثبیت شده اند، می توانند با توالی های مکمل خود هیبرید شوند. تکنولوژی میکرواری امکان ردیابی هزاران ژن را بصورت همزمان فراهم می آورد. از جمله مزایای عمده این تکنولوژی را می توان در کوچک سازی واکنش ها به سبب کوچک بودن اندازه چیپ، بررسی نمونه های متفاوت بصورت همزمان و اتوماسیون چه در مرحله ساخت چیپ ها و چه در مرحله افزودن واکنشگرها دانست.
-4تکنولوژی بلاتینگ
-1-4 وسترن بلات روش انتقال پروتئین از یک ژل به یک غشا - سطح جامد - بطور طنزآمیزی، وسترن بلاتینگ - لکه گذاری غربی - نامیده شد. ساترن نام دانشمندی بود که نخستین بار در سال 1975 مولکول های DNA را از یک ژل جدا کننده به یک غشا انتقال داد. روش مزبور از آن روز ساترن بلاتینگ نام گرفت. بطور مشابه روش انتقال مولکول RNA از یک ژل به غشا را که در سال 1977 توسط Alwine و Kemp ابداع گردید، نورترن بلاتینگ نامیدند. بدین ترتیب بلاتینگ پروتئین که به آن وسترن بلاتینگ نیز می گویند، به عنوان شاخه جدیدی از انتقال مولکول ها به غشا معرفی گردید. همچنین از آنجایی که غالباً وسترن بلاتینگ را به کمک اتصال آنتی بادی ها مورد تحلیل و بررسی قرار می دهند، این روند را گاهی ایمونوبلاتینگ نیز می نامند. پس از ابداع روش بلاتینگ پروتئین ها و بدنبال آن شناسایی پروتئین ها به کمک آنتی بادی ها، این روش به سرعت به ابزاری قدرتمند و رایج برای شناسایی و تعیین مشخصات پروتئین ها تبدیل شد.
ساده ترین روش پروتئین بلاتینگ، دات بلاتینگ نامیده می شود. در روش مزبور مولکول های پروتئینی محلول در نمونه به کمک پی پت متغیر یا سرنگ هامیلتون به طور مستقیم به غشا منتقل می شوند. در حالیکه با انجام دات بلاتینگ اطلاعات کیفی در مورد بروز پروتئین بدست می آید اما با این روش نمی توان اطلاعاتی از وزن مولکولی آنتی ژن پروتئینی مورد نظر بدست آورد. همچنین ممکن است اختصاصی بودن روش دات بلاتینگ نیز تحت تأثیر محصولات شکسته شده پروتئین مورد نظر و یا حضور همزمان ایزوفرم های حاصل از تغییرات پس از ترجمه قرار گیرد.روش پیچیده تر دیگر تحت عنوان وسترن بلاتینگ، شامل جداسازی مخلوط پروتئینی بر روی ژل و سپس انتقال آنها به غشای مناسب - نظیر - PVDF می باشد. در این روش یک مولکول پروتئینی از طریق میان کنش آن با آنتی بادی اختصاصی نشاندار شناسایی می گردد. به کمک این روش
