بخشی از مقاله
ساخت و بررسی رهایش کورکومین از نانو کمپلکس کیتوسان/کورکومین برای کاربرد در ترمیم زخم
چکیده
کورکومین یک ترکیب شیمیایی طبیعی موجود در زرد چوبه می باشد که به دلیل خواص عالیش از جمله قابلیت رگ زایی و آنتی باکتریال بودن در پزشکی به کار برده می شوند. در این تحقیق، نانو کمپلکس کیتوسان / کورکومین (Ch/Cr) با درصد وزنی متفاوت توسط روش کمپلکس دارو- پلی ساکارید ساخته شد. نمونه A با نسبت Ch /Cr (1:1) و نمونه B با نسبت Ch/Cr (2:1) تحت آنالیز حرارتی((STA قرار گرفتند. نتایج این آزمون، کپسوله شدن کورکومین در کمپلکس را اثبات کرد. همچنین دمای تخریب و Tg بالا را برای نمونه های A و B نسبت به کورکومین بدون کمپلکس نشان داد. با مقایسه تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)نمونه ها، کاهش میزان اگلومره شدن کیتوسان در نمونه B مشاهده گردید. همچنین ارزیابی بار سطحی و قطر هیدرودینامیکی نمونه ها توسط دستگاه DLS، اندازه قطر نانو کمپلکس A و B را به ترتیب 600nm و 400nm و افزایش بار سطحی مثبت نمونه B را نسبت به نمونه A نتیجه داد. در نهایت آزمون in vitro برای سنجش میزان رهایش کورکومین توسط روش HPLC برای نمونه نانوکمپلکس B انجام گرفت. نتایج، بارگذاری بالا و رهایش آهسته بدون رهایش انفجاری را نشان داد. بنابراین نمونه نانوکمپلکس با درصد وزنی بیشتر کیتوسان می تواند گزینه مناسبی برای کاربرد در پزشکی باشد.
واژههای کلیدی: نانوکمپلکس، رهایش دارو، کیتوسان، کورکومین، ترمیم زخم
-1 مقدمه
زخم یکی از علل اصلی مرگ و میر در سراسر جهان است. به طوری که زخم های سوختگی چهارمین عامل مرگ و میر در سـال 2004 بـوده است و میزان شیوع آن بیشتر از سل و ایدز بوده است.[1] بهبود زخـم یک فرایند پویا است که از سه مرحله تشکیل شده اسـت.[2] اسـتفاده ازبیومتریال های مصنوعی و طبیعی با قابلیت آنتی اکسیدانی با از بـین بردن گونه های اکسیژن فعال (ROS)1 باعث فعال شدن آنزیم هـای از بین برنده رادیکال آزاد در محل آسیب می شـوند کـه ایـن کـار باعـث تسریع در ترمیم زخم می گردد .[3] کیتوسان Ch دومین ماده فـراوان روی زمین است. کیتوسان یک پلـی سـاکارید اسـت کـه از هیـدرولیز پلیمر طبیعی کیتـین بـه دسـت مـی آیـد.[4] ایـن بیومتریـال در آب نامحلول است ولی در محلول هـای آبـی اسـیدی حـل مـی شـود.[5] کیتوسان دارای ویژگی های مطلـوبی ماننـد قابلیـت هموسـتاز، آنتـی باکتریایی، زیست سازگاری و زیست تخریب پذیری می باشد. بنـابراین کیتوسان و کامپوزیت هـای آن در زمینـه هـای زیسـتی، پزشـکی، ژن درمانی و دارو رسانی به طور گسترده به کار رفته اند..[ 5 ]
کورکومین، رنگ دانه زرد استخراج شده از ریشه زرد چوبـه اسـت کـه قرن ها به طور گسترده برای درمان انواع بیماری های التهابی در طـب سنتی مورد استفاده قرار گرفته است .[6] کورکومین دارای خواص ضـد سرطان ، ضد التهاب، انتی باکتریال، ضد دیابتی می باشد.[7] در چنـد ده گذشــته مطالعــات گســترده ای بــر روی خــواص آنتــی اکســیدانی کورکومین Cr برای درمان زخم ها انجام شـده اسـت. نتـایج مطالعـات پیشین حاکی از آن اسـت کـه کورکـومین باعـث کـاهش تـنش هـای اکسیداتیو1 در محل زخم شده و در نهایت باعث افزایش سرعت بهبـود زخم می گردد .[3] کورکومین با تحریک ترشح فاکتور رشـد TGF-12 (فاکتور بسیار مؤثر در بهبود سریع زخم) در محل زخم باعـث افـزایش سرعت ترمیم زخم می گردد.[8] با این حال پتانسیل واقعی کورکومین به دلیل فراهمی زیستی پایین آن به طـور کامـل مـورد بهـروری قـرار نگرفته است .[3] دلایل اصلی پایین بودن فراهمـی زیسـتی کورکـومین ( 1 سوخت وساز سریع در بدن به دلیل نا پایداری درشرایط خنثی یـا قلیایی روده و 2 )حلایـت ضـعیف آن در آب مـی باشـد.[ 9] همچنـین استفاده از دز دارو بالای کورکومین خطر ایجاد سمیت را افـزایش مـی دهد.[ 10] در میان انواع استراتژی های افزایش فراهمی زیسـتی بـدون ایجاد سمیت استفاده از نانو ذرات کورکومین در کنار پوشش دهـی آن با عوامل کنترل کننده رهـایش کورکـومین بیشـتر مـورد توجـه قـرار گرفته است .[9] استفاده از نانو ذرات باعـث کـاهش دز و ازبـین رفـتن خطر ایجاد سمیت کورکـومین مـی گـردد. همچنـین کنتـرل رهـایش کورکومین باعث افزایش زمان ماندگاری و کاهش متابولیسم کورکومین در بدن می گردد.[10] برای این منظور از چندین استراتژی از جملـه، کاربرد کورکومین به صورت نانو ذرات، کپسـوله کـردن کورکـومین در حامـل هـای[11]، اسـتفاده از میسـل هـا[10]، مـواد لیپیـدی[ 12] و لیپوزوم ها.[13] مورد تحقیق و بررسی قرار گرفته است. بـا ایـن حـال عواملی نظیر پیچیدگی روش ساخت، بار گذاری کم کورکومین و هزینه هــای زیــاد تولیــد کــاربرد روش هــای مــذکور بــرای کپســوله کــردن کورکومین محدود کرده است.[ 9] در این تحقیق جهت رهایش کنتـرل شده کورکومین، نانوکمپلکس کیتوسان/کورکومین با روش دارو- پلـی ساکاریدی ساخته شد. سپس خواص زیستی و سطحی نـانو کمـپلکس مورد ارزیابی قرار گرفت.
-2 مواد و روش
-1-2 مواد
کیتوسان با وزن ملکولی متوسط از شرکت سیگما آلـدریچ امریکـا خریداری شد. کورکومین با خلوص%95 ، آلژینات با خلوص %99 ، اسید استیک %100 و هیدروکسید پتاسیم از شرکت مرک آلمان تهیه شد.
-2-2 سنتز نانو کمپلکس کیتوسان/ کورکومین
نانو کیتوسان حاوی کورکومین بـا در صـد وزنـی متفـاوت (1:1) Ch /Cr و Ch /Cr (2:1) توسـط روش دارو-پلـی سـاکاریدی سـاخته شد.[14] در جدول 1 نمونه ها ساخته شده بـا در صـد وزنـی متفـاوت مشــاهده مــی شــود. بــرای نمونــه A ابتــدا 5mg کورکــومین و 5mg کیتوسان به طور جداگانه در محلول آبی حـل شـدند. سـپس محلـول های آماده شده توسط ورتکس مخلوط گردید و به مـدت 25 ثانیـه در حمــام التراســونیک (مــدل LBS14,5L ســاخت شــرکت (FALC قرارگرفت. در مرحله بعد، محلول حاصل در داخل دستگاه سـانتریفیوژ (مدل Z36HK شرکتHERMLE آلمان ) در شرایط 14000 دور و دمای4 درجه سانتیگراد برای مدت زمان 25 دقیقه قرار داده شد. پـس از آن نمونه ها برای مدت زمان 48 ساعت در دستگاه فریز درایر ( مدل OPERON CO., FDO-8606 -کـره) در دمـای -80 خشـک و بـه پودر تبدیل شد.[9]
-3-2 بررسی مورفولوژی نمونه ها
به منظور مطالعه ریـز سـاختار و مورفولـوژی سـطح نمونـه هـا از میکروسکوپ الکترونی روبشـی((SEM اسـتفاده گردیـد. بـرای آمـاده سازی، ابتدا 16mg از نانوکمپلکس هـای A و B در آب دوبـار تقطیـر رقیق و بر روی صفحات آلومینیومی قرار داده شـد. کـل سـطح آن هـا توسط لایه بسیار نازکی از طلا پوشش داده شده و برای تصویر بـرداری در دستگاه SEM با ولتاژ 15 کیلو ولت قرار گرفت.[3]
-4-2 اندازه گیری قطر و بار سطحی نمونه ها
قطر هیدرودینامیکی و بار سطحی نانوکمپلکس های A و B توسط دستگاه(COR DOOUAN-DLS فرانسه) اندازه گیری شد. برای انجام این آزمایش، ابتدا نانوکمپلکس ها در آب دوبار تقطیر رقیق و به کوت مخصوص دستگاه منتقل گردید. باید توجه داشت که محلول بدون حباب باشد. توسط میدان الکتریکی ایجاد شده بین دو صفحه دستگاه باعث ساطع شدن الکترون به سمت محفظه ای که نمونه در داخل آن است می شود. با اندازه گیری میزان تفرق الکترون باز تاب شده قطر و میزان بار سطحی نمونه ها اندازه گیری می گردد.[8]
-6-2 تجزیه تحلیل خواص حرارتی نمونه ها
برای اندازه گیری خواص حرارتی كوركومین ونانوكمپلكس از دستگاه گرما سنج پویشی -STA 409PC( (STA) ساخت شرکت )NETZSCH که شامل نمودار Tgوکا هش وزن است استفاده شد کالیبره کردند دستگاه با ایندیم و نقره انجام گرفت. این تست بر مبنای حرارات دادن نمونه و مقایسه آن با نمونه مرجع ميباشد. در این آزمون ازپودر آلومینا به عنوان مرجع تحت اتمسفرآرگون استفاده شد. نمونه ها به صورت پودر خشک با وزن تقربی 36mg و با ریت حرارتي 5Co/min درگستره دمای 25تا 500پویش شد. از روی دما نگاشت به دست آمده، دمای تخریب و دمای انتقال شیشه ای (Tg) معین شد.[15]
-7-2 تست رهایش دارو
جهت اندازه گیری میزان رهـایش کورکـومین از نـانوکمپلکس از طیف سنجی دستگاه کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد. بـرای اندازه گیری میزان رهایش کورکومین توسط نانو کمپلکس ابتدا کیسـه دیالیز فعال گردید. سپس 5mg از نانو کمـپلکس در داخـل 1ml بـافر فسفات حل شد و داخل کیسه دیالیز ریخته و داخل ارلن حـاوی 5ml محلول PBS قرار داده شد. سپس به مدت 10 روز بر روی شیکر با دور 100rpm در انکوباتور با دمای 37Co گرفـت و نمونـه گیـری در بـازه های زمانی مشخص انجام گرفت.[9] سپس محلول به دستگاه HPLC منتقل گردید و نمودار درصد رهایش کورکومین نسبت به زمـان رسـم گردید.
حهت تعیین میزان داروی بارگذاری شده در داخل نانو کمپلکس، 5 mg از نانو کمپلکس را در داخل 10ml محلول آب و دی کلرومتـان حل گردید. سپس محلول حاصل 10 دقیقـه، سـانتریفیوژ شـد. سـپس محلول به دستگاه HPLC انتقال داده شد.[10]
-5-2 طیف نگاری مادون قرمز تبدیل فوریه
شناسایی گروه های عاملی و پیوند های تشکیل شده در نمونه هـا توسط طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه TENSOR27) (FTIR) ساخت شرکت (BRUKER مورد ارزیابی قرار گرفت. برای انجـام ایـن آزمون نانوکمپلکس های A و B با KBr خـالص مخلـوط و بهصـورت قرص نازک شکلدهی شد. سپس توسط دستگاه FTIR قله های جذب پرتــو IR درطــول مــوج هـای در محــدوده 400 -4000 Cm -1 مشــاهده و نــوع پیونــد هــا بــا بررســی طــول مــوج قلــه هــا مشــخص گردید.[14]
-3 نتایج و بحث
-1-3 بررسی مورفولوژی سطح نمونه ها
شکل 1 مورفولوژی سطح نانوکمپلکس A و B را نشان می دهند. بـا توجه به تصاویر می توان اندازه نانو کمـپلکس A و B را بـه ترتیـب در محــدوده600nm و 400 nm تعیــین کــرد. ســطح نــانو کمــپلکس کیتوسان/کورکومین A و B صاف می باشـد کـه نشـان دهنـده ایجـاد پیوند و سازگاری مناسب بین مولکول های کیتوسان و کورکومین مـی باشد.[16] نـانوکمپلکس A نسـبت بـه نـانوکمپلکس B دارای انـدازه ذرات بزرگتری می باشد. چون نانوکمپلکس A دارای مقـدار کیتوسـان کمتری نسبت به نمونه B می باشد. ایـن امـر موجـب آگلـومره شـدن بیشتر ذرات نانوکمپلکسA و در نتیجه باعث افزایش اندازه ذرات آن ها می گردد.[9]
شکل -1 تصاویر (a SEMنانو کمپلکس A و (b نانو کمپلکسB
-2-3 بررسی بار سطحی وقطر هیدرودینامیکی نانو کمپلکس ها
توسط دستگاه DLS بار سطحی نانو کمپلکس A و B به ترتیـب در محدوده + 18 mV و + 24 mV انـدازه گیـری شـد. کیتوسـان خالص دارای بار سطحی + 57 mV و کورکـومین دارای بـار سـطحی - 40 mV می باشد. بنابراین هر چقدر میزان کیتوسان در سـطح نـانو کمپلکس بیشتر و کورکومین در مرکز آن بیشتر قرار داشته باشـد، بـار سطحی مثبت تر می گردد. افزایش بار سطحی نمونه B نسبت به نمونه A به دلیل افزایش میزان رسوب کیتوسان واکنش نداده بر روی سـطح نانوکمپلکس می باشد.[15] اندازه ذرات نمونه A و B به ترتیـب nm 600 و400 nm می باشد. علت افزایش اندازه ذرات در نانوکمپلکس A به دلیل آگلومره شدن نانو کمپلکس ها در اثر کاهش میزان بار سطحی نانو کمپلکس ها در نتیجه کمتـر شـدن نسـبت کیتوسـان مـی باشـد. تصاویرSEM (شکل (1 تأییدی بر درستی این نتایج می باشد.[14]
-3-3 طیف سنجی تبدبل فوریه( (FTIR
در شکل 2 طیف FTIR نانو کمـپلکس B را در محـدوده طـول مـوج 400-4000cm-1 مشــاهده مــی گــردد. حضــور گــروه هــای عــاملی (NH3+)،((N-C و (NH) در کنــار حضــور گــروه هــای (Cring-C=C)، (Cring=C)، (C=O)، (Cring-O-CH3)، (CHring)، (c-o-c) و Cring-) (OH نشان دهنده وجـود گـروه هـای اصـلی کورکـومین و کیتوسـان درنانوکمپلکس می باشد. همچنین حضور و تغییر نوسان مشاهده شده در طول موج مربوط به گروه هـای((C-C، (OH) و (CH) نسـبت بـه طیف کورکومین و کیتوسان، وجود هـر دو مـاده را در نـانو کمـپلکس ثابت می کند14]،.[9
پیــک ارتعاشــی ظــاهر شــده در طــول مــوج 3449 Cm -1 معــرف هیدروکسیل (OH) و آمین (NH) در کیتوسان می باشـد .[ 17] پیـک موجود در طـول مـوج 2925 Cm -1 معـرف گـروه عـاملی (NH3+) و پیک هـای در طـول مـوج هـایCm -1 2858 Cm -1 ،1649 ،Cm -1 1149و1119 Cm -1 به ترتیب به گروه هـای((CH، (C-N) ، (C-C) و (CH3) در کیتوسان مرتبط می باشند.[5] پیک ارتعاشی ظاهر شـده در طول موج های 3515 Cm -1 و2850 معرف هیدروکسـیل((OH و (CH) کورکومین می باشد.[9] همچنین پیک های موجـود در طـول موج های1625 Cm -1 ،1604 ،1429و860 مـرتبط بـه (Cring-OH)، (Cring=C)، (Cring-C=C) و (Cring-O-CH3) و پیــک هــای مشــاهده شده در محدوده طول موج های 713-959 Cm -1 منسوب به لغـزش ترانس و سیس((CHring می باشند. پیک رویـت شـده در طـول مـوج 1281 Cm -1 معرف (C-O) انول و پیک ظاهر شـده در طـول مـوج 1149 Cm -1
