بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه، تروپان آلکالوئید هاي هیوسامین و اسکوپولامین، ترکیباتی دارویی با قدرت عمل بر روي سیستم عصبی پاراسمپاتیک هستند که به عنوان عوامل آنتی کولینرژیک کاربرد دارند. ، این مواد به طور گسترده به وسیله گیاهان تیره سیب زمینی Hyoscyamus ,Duboisia ,Datura ,Atropa و Scopoliaتولید می شوند. سالسلیک اسید - SA - فنلی گیاهی است که به عنوان تنظیم کننده یا هورمونی درون زا عمل مینماید و مکانیسم هاي دفاعی در برابر انواع تنشهاي زیستی و غیر زیستی را براي کاهش اثرات آسیب زننده آنها به راه میاندازد.
پوترسین -N متیل ترانسفراز - - PMT ، منومتیلاسیون دي آمین پوترسین را کاتالیز میکند و منجر به تولید-N متیل پوترسین - NMP - و -Sآدنوزین هوموسیستئین - SAH - می شود. هیدروکسی هیوسیامین-β-6 هیدروکسیلاز - - H6H، یک دیاکسیژناز وابسته به -2 اگزوگلوتارات است که هیدروکسیله شدن هیوسیامین به β-6 هیدروکسی هیوسیامین و همچنین تبدیل آن را به اسکوپولامین کاتالیز میکند. هدف، هدف از این مطالعه تاثیر تیمار سالسیلیک اسید بر بیان ژن هاي h6h و pmt در گیاه تاتوره تماشایی می باشد.
روش، براي تیمار گیاهچه هاي ریزازدیادي شده تاتوره تماشایی، از قطعات جداکشت تک گره شامل دو جوانه جانبی در محیط کشت MS حاوي 0/5 میلی مولار IAA همراه با غلظتهاي 0، 0/01، 0/05، 0/1 میلی مولار سالسلیک اسید استفاده شد. استخراج RNA تام از برگ گیاهچه ها با استفاده از کیت - Cinagen - RNax plus صورت گرفت. نتیجه، سطوح بیان ژن h6h و pmt به روش نیمه کمی با استفاده از ژن خدمتکار - housekeeping - توبولین به عنوان کنترل داخلی انجام شد. افزایش بیان آنزیم کلیدي H6H و PMT تحت تاثیر سالسلیک اسید بود.
مقدمه
تیره سیب زمینی یکی از تیرههاي مهم با 58 جنس و نزدیک به 2000 گونه است که 900 گونه آن را فقط جنس سولانوم تشکیل میدهد. تعدادي از گیاهان این خانواده Hyoscyamus ,Duboisia ,Datura ,Atropa و Scopoliaبه دلیل تولید الکالوئیدهاي مهم در طب گیاهی به عنوان داروهاي گیاهی استفاده میشوند . - 4 - گیاه تاتوره تماشایی - Datura - innoxia گیاهی علفی، ایستاده، یکساله و یا به صورت درختچه چند ساله با ساقه بسیار منشعب است - . - 3 بیوسنتز تروپان الکالوئیدها مانند هیوسیامین و اسکوپولامین با تشکیل یون – N متیلپیرولینیوم از آمینواسیدهاي اورنیتین و آرژنین آغاز میشود.
- 5 - پوترسین -Nمتیلترانسفراز آنزیم دخیل در برداشت پوترسین از مخزن پلیآمین میباشد و -N متیلاسیون ديآمین را به شکل -Nمتیل پوترسین کاتالیز میکند. در آخرین مرحله مسیر بیوسنتزي تروپان الکالوئیدها، هیوسیامین توسط آنزیم هیوسیامین -6 هیدروکسیلاز - H6H - ، یک دياکسیژناز وابسته به -2اکسوگلوتارات، هیدروکسیلاسیون هیوسیامین را به -6 هیدروکسی هیوسیامین و نیز اپوکسیداسیون -6 هیدروکسی هیوسیامین را به اسکوپولامین - هیوسین - ، کاتالیز میکند.
مواد و روش ها
ماده گیاهی به کاررفته بذر گیاه تاتوره تماشایی از پایه هاي خودروي این گیاه در شمال غرب تهران - طول 51° 22ʹ 52ʺ شرقی و عرض 35° 46ʹ 21ʺ شمالی - جمع آوري شد. واکنش زنجیره اي ترانس کریپتاز معکوس - RNA : - RT – PCR کل از برگ و اندام هوائی گیاه تاتوره تماشایی ، با استفاده از محلول - Cinnagen - - RNA extraction solution - RNX و مطابق دستورالعمل پیشنهادي شرکت سازنده استخراج شد. سپس کیفیت RNA استخراج شده، با استفاده از ژل آگارز و اسپکتروفتومتر ارزیابی گردید.
از 5 میکروگرم، RNA کل با استفاده از الیگومر تیمیدین - 18Oligo – dT - به عنوان آغازگر - Primer - براي ساختن cDNA استفاده شد. ساختن cDNA با استفاده از کیت - Cinnagen - و طبق دستور شرکت سازنده آن انجام شد. به منظور بررسی بیان ژن هاي h6h وpmt از آغازگر هاي اختصاصی مربوط به این ژن ها در گیاه شابیزك - Atropa belladonna - استفاده گردید. با استفاده از برنامه BLAST در سایت NCBI عملیات هم ردیف سازي1 براي ژن h6h انجام گرفت که همولوژي و حفاظت شدگی زیادي را بین توالی نوکلئوتیدي این ژن در گیاه آتروپا و تاتوره تماشائی نشان داد، مخصوصا در محل اتصال آغازگرها تائید گردید. به عنوان کنترل داخلی از آغازگرهاي اختصاصی پیشرو براي تکثیر cDNA ژن توبولین - House keeping - در RT-PCR استفاده شد. آغازگرها با استفاده از توالی هاي cDNA مربوط به ژن هاي h6h وpmt و توبولین که از سایت NCBI به دست آمد، طراحی شدند - جدول . - 1
نتایج وبحث
سالیسیلیک اسید - SA - یکی از مولکولهاي علامت رسان استرس در گیاهان میباشد که نقش مهمی در پاسخ هاي گیاه به پاتوژنها و دیگر عوامل تنش زا ایفا می کند . - 6 - و به عنوان یک ماده علامت رسان کلیدي که در فعالسازي پاسخهاي دفاعی گیاهان شرکت میکند، شناخته شده است . - 7 - سالیسیلیک اسید همچنین موجب افزایش بیان ژنهاي مربوط به بیوسنتز و تولید گروهی از متابولیتهاي ثانویه در گیاهان میشود.
نتایج بررسی بیان ژن هاي H6Hو PMT در برگچه هاي تاتوره تحت تأثیر غلظت هاي مختلف 0 - ، 0/01، 0/05، 0/1 میلی مولار - سالیسیلیک اسید نشان داد که بیان ژن h6h در غلظت 0/1 میلی مولار نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت و در غلظت 0/01 و 0/05 میلی مولار کاهش یافت و به حد شاهد رسید - شکل . - 1 این نتایج با نتایج بدست آمده از تحقیقات تشکري و همکاران مطابقت دارد. با توجه به اینکه آنزیم H6H در تبدیل آتروپین به اسکوپولامین نقش دارد، به نظر می رسد که افزایش مقدار اسکوپولامین توسط سالیسیلیک اسید مربوط به افزایش بیان ژن H6H در اثر سالیسیلیک اسید باشد.
شکل-1 تغییرات بیان ژن h6h در برگ تاتوره تماشائی تحت تاثیر غلظت هاي سالسیلیک اسید SA1 - و SA2 وSA3 به ترتیب مربوط به غلظت هاي 0/01 و 0/05 و . - 0/1 نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR ژن هاي مذکور و توبولین - به عنوان کنترل داخلی - . نمودار مربوط به مقدار کمی بیان ژن ها پس از اندازه گیري شدت باند ها با نرم افزار.Total Lab بیان ژن pmt در غلظت 0/05 میلی مولار نسبت به شاهد افزایش زیادي یافت. ولی در غلظت 0/1 میلی مولار نسبت به شاهد کاهش یافت . - شکل . - 2
