بخشی از مقاله
چکیده
هدف از این تحقیق، جداسازی و شناسایی باکتریهای و بررسی ویژگی پروبیوتیکی آنها در ورمی کمپوست حاصل از کود گاوی می باشد. برای رسیدن به این هدف، باکتریهای موجود در ورمی کمپوست توسط روشهای فنوتیپی - مورفولوژی سلولی، رنگ آمیزی گرم و زیل نلسون، تست کاتالاز، اکسیداز، TSI، SIM وسیترات وتستهای بیوشیمیایی شامل رشد در غلظتهای مختلف نمک و نیز تخمیرانواع قندها - جداسازی شدند و پتانسیل پروبیوتیکی آنها - مقاومت به اسید معده و نمکهای صفراوی - مورد ارزیابی قرارگرفت.باکتری های جدا شده دارای خاصیت پروبیوتیکی می باشد و می توان از ورمی کمپوست به عنوان منبع پروبیوتیک در خوراک دام استفاده شود که باعث متعادل کردن میکروفلور روده، و بهبود باز دهی خوراک وتحریک سیستم ایمنی دام می شود.
مقدمه
باکتریهای پروبیوتیک به عنوان مکملهای غذایی زنده میکروبی، با اصلاح تعادل میکروبی روده، میزبان را تحت تأثیر قرار میدهند. اخیراً آزمونهای بالینی اثرات مفید باکتریهای پروبیوتیک از قبیل پیشگیری از اسهال، متعادل کردن میکروفلور روده،تحریک سیستم ایمنی، تعدیل هموستازی ایمنی سیستمیک و خصوصیات ضد توموری را نشان داده اند. همچنین محققان به این نتیجه رسیدند که باکتریهای پروبیوتیک با تولید باکتریوسینها و اسیدهای آلی، رشد پاتوژنها را مهارمیکنند. - - 10 امروزه تولید ورمی کمپوست برای فرآوری ضایعات آلی مورد استفاده قرار می گیرد - . - 2 عبور ضایعات آلی از مسیر دستگاه گوارش کرم خاکی و آغشته شدن این مواد به آنزیم ها، مواد مخاطی، متابولیتها و میکرو ارگانیسم های دستگاه گوارش در مجموع موادی با ارزش غذایی بالا را تولید کرده که احتمالا می توان به عنوان پروبیوتیک و پریبیوتیک در تغذیه دام از آن استفاده نمود. . - 1 -
اهداف
هدف از این تحقیق جدا سازی و شناسایی باکتری هایی با پتانسیل پروبیوتیکی موجود در ورمی کمپوست حاصل از کود گاوی می باشد.
روش کار
ورمی کمپوست استفاده شده برای آزمایش، در کارگاهی در روستای حاجی آباد بیرجند تحت شرایط دما، رطوبت و هوادهی استاندارد با استفاده از کرم خاکی گونه Eisenia Foetida و کود پوسیده 6 ماهه دامی تهیه شد. بعد از الک کردن مقدار مورد نیاز برای آزمایش به صورت تصادفی برداشت شد. ورمی کمپوست با تراکم 600 گرم کرم خاکی در 10کیلو گرم بستر کود گاوی به مدت 3 ماه آماده شد.
تهیه سوسپانسیون باکتریایی
از نمونه های هر تیمار 10گرم در سرم فیزیولوژیکی 0/9درصد به حجم 100 سی سی رسانده شد و به آرامی تکان داده شد تا همگن گردد سپس برای کشت و جدا سازی و خالص سازی سویه های باکتری و انجام تست های بیوشیمیایی 1 سی سی از سوسپانسیون به پلت های حاوی MRS آگار منتقل انکوبه گردید. تمامی این مراحل در زیر هود لامینارو شرایط استریل انجام شد. - - 3 غربال جمعیت باکتریایی اولیه و انتخاب سویه های مقاوم به اسید و مقاومت به نمکهای صفراوی برای این دو آزمایش از کشت 24 ساعته، یک کلنی برداشته ودر محیط MRS براث استریل شده کشت داده و به مدت 16-18 ساعت در انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد.تعیین تحمل به اسیدیته برای تمام سویه ها، در بافر PBS با pH برابر با 3 به طول 0، 1 و 2/5 ساعت در 37 CO انجام شد پلیت ها به مدت 72-48 ساعت در شرایط کم هوازی در در انکوباسیون قرار داده شد.
بعد از این مدت مشاهده رشد باکتری در سطح پلیت نشان دهنده مقاومت باکتری به شرایط اسیدی بود - . - 9 تعیین مقاومت به نمک های صفراوی درمحیط کشت MRS مایع به عنوان کنترل و MRS مایع3 درصد املاح صفراوی به عنوان کشت مورد آزمایش - تیمار - به طور همزمان با یک درصد از کشت باکتریایی فعال 24 ساعته تلقیح شد و در دمای 37 CO انکوبه شدند . رشد در کشتهای کنترل و تیمار، هر نیم ساعت یکبار با اندازه گیری جذب نوری در طول موج 600 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا کنترل شد رشد به مدت 8 ساعت دنبال شد و اعداد ثبت گردیدو با نرم افزار SAS آنالیز گردید - . - 9
آزمایشهای بیوشیمیایی
براساس روشهای توصیه شده شناسایی مورفولوژیکی سویه ها با استفاده از تستهای کاتالاز، اکسیداز، سیترات، TSI وSIM ،رنگ آمیزی گرم و رشد درغلظتهای مختلف نمک - 4 و6/5 درصد حجمی -وزنی کلریدسدیم در محیط کشت MRS مایع - 6 - و - 7 و مطابق روش مارای و همکاران - - 8 الگوی تخمیر قند ها - گلوکز، فروکتوز، سوکروز و لاکتوز - انجام شد.
نتایج و بحث
از مجموع باکتری های استخراج شده بر اساس مشاهدات مورفولوژیک، کلنیهای غیر مشابه خالص سازی شد به صورت کلنی تک درپلیت های جدید کشت خطی داده شدند. از 10 مرحله خالص سازی و تکرار آزمایش160پلیت خالص به دست آمدکه تمامی تست های بیوشیمیایی ذکر شده در قسمت مواد و روش برای آنها انجام شد وتحمل اسیدیته بالا و مقاومت به نمکهای صفراوی ازجمله خصوصیات اولیه و ضروری تحقیق برای غربالگری سویه های با پتانسیل پروبیوتیکی در نظرگرفته شده است.
نتایج آزمون ها در وبسایت http://www.tgw1916.net/ قسمت شناسایی باکتری ها وارد شد. با توجه به نتایج تست ها، بیشترین درصد احتمال، برای وجود 5 خانواده و چند سویه مشخص به دست آمد که شامل: الف - انتروباکترها - E.cancerogenus, E.hormaechei, haemolyticus - ، باسیل ها - - B.mycoides, B. anthracic, B.cereus, B.thuringiensis, B.subtilis, B.pumilus می باشند. همه این موارد با احتمال بالای %90 شناسایی شدند و با توجه به نتایج آزمایشات دارای پتانسیل پروبیوتیکی می باشند.
در تحقیقات مشابه برای انتخاب سویه های لاکتوباسیلوس مقاوم به اسید با استفاده از محتوی معده بافر PBS با pH مناسب برای غربال سویه های باکتریایی، به منظور حفظ بقا در شرایط " "in vivo پیشنهاد شده است 4 - و. - 5 بعد از انتخاب باکتریهای مقاوم به اسید و تعیین میزان تحمل آنها به شرایط اسیدی و نمکهای صفراوی و شناسایی مقدماتی آنها با استفاده از تستهای بیوشیمیایی و با توجه به مشخصات فنوتیپی، بیوشیمیایی و الگوی تخمیر قندی سویه های مختلف مشخص شد که. باکتریهای جدا شده دارای خاصیت پروبیوتیکی می باشد و می توان از ورمی کمپوست به عنوان منبع پروبیوتیک در خوراک دام استفاده نمود.
