بخشی از مقاله
چکیده:
امروزه افزایش بیماري ها و پیدایش باکتري هاي مقاوم به آنتی بیوتیک ها، محققین را بر آن داشته تا با روش هاي جدید و بکارگیري میکروارگانیسم هاي مفید از جمله پروبیوتیک ها، درمان و کنترل بیماري ها را میسر کنند. بنابراین جداسازي، شناسایی و تولید این میکروارگانیسم هاي مفید با خصوصیات جدید پروبیوتیکی از منابع و زیستگاه هاي طبیعی مختلف براي افزایش سلامت در انسان، دام و طیور و حتی آبزیان اهمیت بسیار ویژه اي پیدا کرده اند.
در این تحقیق، حدود 200 لاکتوباسیلوس ها از سیستم گوارش مرغ هاي بومی نژاد و مازندران، توسط روش هاي فنوتیپی جداسازي شدند و شاخص هاي اولیه پروبیوتیکی آنها مورد ارزیابی قرار گرفت. براي شناسایی دقیق تر با جفت آغازگرهاي اختصاصی، ژن 16s rDNA جدایه ها تکثیر داده شد.
در پایان تحقیق 21 سویه لاکتویاسیلوس با پتانسیل پروبیوتیکی بالا تشخیص داده شد. که توانایی مهار پاتوژن ها و مقاومت آنتی بیوتیکی آنها بررسی شد. سپس به منظور انتخاب برترین سویه ها براي آزمون هاي مزرعه اي، جدایه هاي انتخاب شده در آزمایش تکمیلی، بررسی قابلیت چسبندگی به سلول هاي اپی تلیال - CaCo-2 - ، مورد ارزیابی قرار خواهند گرفت.
مقدمه:
در طول دو دهه اخیر انتشار مسمومیت هاي غذایی به وسیله پاتوژن هاي روده اي در انسان، طیور و دام افزایش پیدا کرده است - Ministry of Health, Welfare, 2009 - استفاده از لاکتوباسیل ها به عنوان یک شیوه موثر در کاهش دادن عفونت هاي پاتوژنی در صنعت طیور پیشنهاد شده است - . - Van coili et al., 2007 لاکتوباسیلوس ها با استفاده از تولید اسیدهاي آلی و باکتریوسین ها - Jin et al., 1996 - و همچنین با ممانعت از اتصال پاتوژنها به اپیتلیوم روده از طریق رقابت در جایگاه هاي اتصال و تحریک کردن سیستم ایمنی میزبان از رشد باکتري هاي پاتوژن جلوگیري به عمل می آورند.
باکتريها: مهمترین دسته پروبیوتیکها میباشند که شامل باکتريهاي تولید کننده اسید لاکتیک نظیر لاکتوباسیلها، استرپتوکوكها، بیفیدوباکترها و سایرباکتريها از قبیل پدیوکوکوس، پرپیونی باکتریدیوم، لوکونوستوك و باسیلوس - سوبتیلیس،لیشن فرمیس،بوتوئی و.... - میشوند
باکتريهاي اسید لاکتیک رایجترین گروه تشکیل دهنده پروبیوتیکها هستند . گروه باکتريهاي اسید لاکتیک داراي خصوصیاتی نظیر گرم مثبت بودن، مقاومت در برابر اسید، عدم تشکیل اسپور، به شدت تخمیري بودن و دارا بودن اسید لاکتیک به عنوان فرآورده اصلی تخمیر قندها میباشند
با توجه به اینکه مرغ هاي نژاد بومی داراي قابلیت تحمل بسیار بالایی به تنش هاي زیستی و غیر زیستی، بدلیل تنوع ژنتیکی قوي و وجود فلور میکروبی موثر و مفید در سیستم گوارش آنهاست. لذا هدف از اجراي تحقیق حاضر، جداسازي و شناسایی لاکتوباسیل ها با پتانسیل پروبیوتیکی بالا از سیستم گوارش مرغ هاي بومی نژاد مازندران با استفاده از تکنیکهاي بیوشیمیایی، ژنومیکسی و انتخاب گونههاي بومی مناسب جهت استفاده صنعتی به عنوان جایگزین سویههاي وارداتی اجرا شده است.
مواد و روش ها:
در این تحقیق بعد از جمع آوري نمونه هاي ایلئوم مرغ با سن کمتر از یک سال از ایستگاه هاي نگهداري مرغ هاي نژاد بومی مازندران، شناسایی مقدماتی و بیوشیمیایی ایزوله ها انجام شد. ابتدا تهیه سوسپانسیون باکتریایی توسط روش کالیچا و همکارانش با استفاده از محلول ١PPS و کشت اولیه باکتري ها در محیط کشت MRS مایع صورت گرفت. سپس جهت جداسازي لاکتوباسیلوس ها، کشت هاي باکتریایی با تهیه سري رقت بر روي محیطهاي MRS agarتلقیح می شوند. کلنی هاي کاملا مجزا از هر پلیت حاوي محیط MRS به طور تصادفی انتخاب شدند.
در این مرحله باسیل هاي گرم مثبت و کاتالاز منفی براي ادامه مراحل بعدي انتخاب می شوند. تعیین مقاومت جدایه ها به نمک هاي صفراوي با روش گلیلند و همکاران در محیط MRS مایع به عنوان کنترل و MRS مایع حاوي %0/5 بایل oxgall و میزان مقاومت به pH 2.5 با روش کولادو و همکاران در محیط MRS مایع به عنوان کنترل و MRS مایع حاوي HCl - pH 2.5 - ، بر اساس جذب نوري سوسپانسیون میکروبی بین0/25 -0/3 مربوط به هر جدایه در 600 نانومتر انجام شد. رشد در کشت هاي کنترل و تیمار هر یک ساعت یک بار با اندازه گیري جذب نوري در طول موج 600 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت گردید. سپس درصد رشد آنها در طی این هشت ساعت بررسی شد.
آنالیز داده ها با استفاده از نرم افزار MINITAB و جدول تجزیه واریانس - ANOVA - در سه تکرار صورت گرفت. جدایه هاي مقاوم به نمک صفراوي و اسید تحت آزمون رسوب به روش رنیرو و همکاران قرار گرفتند. بدین صورت که لوله هاي حاوي سوسپانسیون باکتریایی به مدت 2 ساعت، هر 15 دقیقه یک بار مورد ارزیابی قرار گرفتند. رسوب وقتی مثبت است که توده باکتریایی در انتهاي لوله تجمع یافته و محلول سوپرناتانت شفافی ایجاد نماید. در ادامه توانایی مقاومت به غلظت بالاي نمک %6، 10%، %15 و توانایی رشد در دماهاي 4/5 °C و 45 °C جدایه هاي با قابلیت تراکم بالا به روش کفیلی و همکاران بررسی شد.
مرحله دوم شناسایی جدایه ها به روش مولکولی انجام شد. بدین منظور DNAي ژنومی باکتري هاي لاکتوباسیل با استفاده از کیت شرکت QIAamp طبق دستورالعمل مربوطه استخراج شد. پس از استخراج DNA، با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ژن 16s rDNA، PAF - 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' - و - 'PAR - 5' AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 با استفاده از برنامه و پروتکل واکنش زنجیره اي پلیمراز در 30 سیکل تکثیر شدند
- جداول . - 1 جهت شناسایی نهایی نمونه هاي تکثیر یافته به مرکز توالی یابی Seqlab آلمان فرستاده شد و پس از توالییابی قطعات تکثیري، به منظور شناسایی گونهها از نرم افزارهاي Chromas، Bioedit، DNAstar و Blast استفاده شد. براي ارزیابی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه ها از روش دیسک پلیت Kirby- Bauer استفاده شد. سویه ها به صورت متراکم بر روي محیط کشت MRS agar کشت داده شد.
پس از جذب شدن رطوبت ناشی از سوسپانسیون باکتریایی توسط محیط، دیسک هاي آنتی بیوتیک مورد نظر براي هر سویه بر روي محیط قرار داده شد. پس از 24 ساعت گرمخانه گذاري - 24 ساعت، - 37 °C، هاله هاي عدم رشد اندازه گیري شدند - سه تکرار - . دیسک هاي آنتی بیوتیکی شامل سیپروفلوکساسین ، کوتریموکسازول، کلرامفنیکل، اکسی تتراسیکلین، تایلوزین بودند.
براي بررسی اثرات ضد میکروبی سویه ها از روش کشت دولایه اي استفاده شد. در این روش 50 μ از هرسویه در وسط پلیت حاوي محیط MRS agar قرار داده شد و در 37°C به مدت 24 ساعت به صورت بی هوازي گرم خانه گذاري شدند. پس از رشد سویه ها، محیط مولر هینتون آگار - MHA - مذاب بر روي محیط MRS agar حاوي پروبیوتیک ریخته شد و پس از بستن محیط، باکتري هاي پاتوژن به صورت متراکم بر روي محیط MHA کشت داده شدند. پس از گرم خانه گذاري در 37°C به مدت 24 ساعت به صورت هوازي، از نظر قطر هاله عدم رشد بررسی شدند - سه تکرار - .
جدول 1 برنامه واکنش زنجیره اي پلیمراز
نتایج و بحث
ازمحتویات ایلئوم تعداد هشت مرغ و خروس بومی، در کل 200 کلنی مجزا، جداسازي گردید که پس از رنگ آمیزي گرم و تست کاتالاز، 189 جدایه به عنوان باکتري میله اي گرم مثبت و کاتالاز منفی شناسایی شدند.
نتایج درصد رشد جدایه ها در شرایط اسیدي نشان داد که بیشتر باکتريهاي ایزوله شده، توانایی تحمل به شرایط اسیدي، رشد و زنده مانی را دارند، ولی درصد رشد آنها متفاوت بود. به گونه اي که برخی از آنها درصد رشد بسیار پایین تري نسبت به درصد رشد در شرایط کنترل رشد در محیط کشت مایع MRS - pH 5.5 - داشتند. در این مرحله جدایههایی که درصد رشد آنها نزدیک به درصد رشد در شرایط کنترل بود انتخاب شدند و بقیه حذف شدند.
نتایج مربوط به مقاومت به نمک هاي صفراوي نشان داد که نمکهاي صفراوي تاثیر ممانعت کنندگی بر روي برخی از جدایه ها دارند. از طرف دیگر نتایج نشان داد که نمکهاي صفراوي هیچ گونه تاثیري بر روي برخی از جدایه ها نداشت بطوري که تفاوت معنی داري - در سطح - %5 بین درصد رشد آنها در شرایط کنترل و حضور نمکهاي صفراوي وجود نداشت. در این مرحله نیز جدایههایی که درصد رشد نزدیکتري به درصد رشد در شرایط کنترل بود انتخاب شدند و بقیه حذف شدند - نتایج درصد رشد جدایه هاي انتخاب شده نهایی در شرایط اسیدي و حضور نمک هاي صفراوي در جدول2 آمده است - .
در نهایت 79 جدایه که هر دو شرایط اسیدي و نمکهاي صفراوي را تحمل کردند براي آزمون رسوب - Auto-aggregation - ، انتخاب شدند.
جدول4 نتایج حاصل از قابلیت تراکم و رسوب جدایه هاي بومی را نشان می دهد. جدایههایی که در زمان کمتر از 120 دقیقه قادر به ایجاد یک محلول شفاف رویی بودند و باکتري بطور کامل رسوب تشکیل می دادند به عنوان باکتري هاي با پتانسیل پروبیوتیکی در نظر گرفته شدند. میزان تراکم و قابلیت رسوب می تواند معیاري براي توانایی چسبندگی به دیواره روده باشد. تمامی جدایه هاي مورد آزمون قادر به تحمل دماهاي 4/5 °C و 45°C و
نمک تا %10 بودند. جزئیات بیشتر در جدول 3 آمده است.
در شناسایی مولکولی، محصولات حاصل از PCR بر روي ژل آگارز 1 درصد تفکیک و ارزیابی شدند و باندهاي مورد نظر با سایز مارکر 1 kb plus، SMO323 شرکت فرمنتاز مقایسه شد، قطعه مورد انتظار به اندازه 1500 نوکلئوتید در تمامی جدایه ها مشاهده شد - شکل . - 1 نتایج شناسایی مولکولی نشان داد که در نمونههاي گوارش مرغهاي نژاد بومی مازندران توالی هاي جدایه هاي منتخب 21 - جدایه - داراي بیشترین شباهت - بیش از 98 درصد - به یکی از گونههاي باکتریاییL. reuteri، L. vaginalis ،L. agilis،L. oris وL. salivarius بودند و توالی هاي مربوط به هر سویه در بانک ژنی NCBI ثبت شدند
جدول 2 نتایج حاصل از آزمون مقاومت به اسید و نمک هاي صفراوي - درصد رشد پس از 7 ساعت را نشان می دهد -
