بخشی از مقاله
چکیده :
با پیدایش روشهای سریع و آسان به منظور اندازه گیری پروتئین مانند روشهای رنگ سنجی، روش کلدال نیز هنوز به عنوان روشی مورد تایید و مرجع مورد استفاده قرار میگیرد. با توجه به اهمیت فاکتور تبدیل نیتروژن به پروتئین در تعیین کمی پروتئین به روش کلدال و همچنین زمان بر بودن و پیچیدگی نسبی محاسبه آن برای هر پروتئین، این نرم افزار بستر این امر را محیا میکند که پژوهشگران به راحتی با صرف زمانی بسیار کمتر بتوانند، میزان پروتئین را بطور دقیق تعیین نمایند. این برنامه کاربردی توسط نرم افزار برنامه نویسی Visual Basic 6.0 در 4500 خط برنامه نویسی، نوشته شد و تحت محیط ویندوز قابل استفاده می باشد.
این نرم افزار به صورتی طراحی شده است که تنها با وارد کردن میلیگرم هر 21 اسید آمینه حاصل از آنالیز کروماتوگرافی و یا تعداد هر اسید آمینه در نمونه پروتئین و یا حتی درصد آنها در جای مشخص شده، می تواند فاکتور پروتئین کلدال آن را با سرعت پردازش 0/001 ثانیه مشخص نماید.
به منظور انجام محاسبه فاکتور پروتئین توسط این نرم افزار، پروفایل اسیدهای آمینه شش نوع پروتئین ژلاتین با منابع مختلف توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا مشخص گردید و فاکتور پروتئین هر ژلاتین توسط نرم افزار محاسبه شد. فاکتور پروتئین کلدال برای شش نمونه ژلاتین با توجه به پروفایل اسیدهای آمینه آنها در کمتر از چند دقیقه صورت گرفت. نتایج حاکی از این بود که میانگین شش نمونه ژلاتین با منابع مختلف از قبیل استخوان گاو، استخوان گوسفند، پوست گاو، خوک، ماهی و کوسه برابر با عدد 5/35 است.
-1 مقدمه :
از گذشته تا به امروز، تعیین کمی میزان پروتئین مواد غذایی با توجه به نقشهای کلیدی آن از قبیل دستیابی به ویژگی های مطلوب در فرمولاسیون و تولید مواد غذایی و ارزیابی ارزش تغذیهای مواد غذایی و… مورد توجه بوده استهمچنین. تخمین مقدار پروتئین در کشف تقلّبات و تطبیق فرآورده با اطّلاعات مندرج در بر چسب بسته بندی و نیز انجام کارهای پژوهشی از اهمیت بالایی برخوردار است. میزان کل تولید مواد غذایی جهان در سال 2010، 6 میلیارد تن تخمین زده شده است، به طور متوسط اگر حد پروتئین در مواد غذایی را %10 در نظر بگیریم سالیانه 600 میلیون تن پروتئین تولید میشود
جوهان کلدال2 در 16 آگوست سال 1849 در شهر جایگرپریس3 دانمارک به دنیا آمد. در سال 1876 توسط کارلسبرگ بروری4 برای مطالعه و تکمیل آزمایش ارائه شده برای سنجش پروتئین غلات مشغول به کار شد و روش کلدال در سال 1883 منتشر گردید. در حال حاضر، روش اصلی به مقدار زیادی اصلاح شده است. مراحل کلیدی سنجش شامل هضم نمونه، خنثی سازی، تقطیر، به دام انداختن آمونیاک و تیتر کردن با اسید استاندارد و در نهایت ضرب کردن میزان نیتروژن محاسبه شده در فاکتور تبدیل نیتروژن به پروتئین کلدال است
اساس کار روش کلدال محاسبه میزان نیتروژن مواد غذایی به صورت آمونیاکی می باشد که از طریق ضرب در فاکتور پروتئین کلدال یا همان درصد میزان نیتروژن به پروتئین مواد غذایی، میزان کمی پروتئین بدست می آید. حال با توجه به تفاوت در میزان اسیدهای آمینه پروتئین های مواد غذایی، میزان فاکتور پروتئین برای مواد غذایی گوناگون دارای اختلاف است، به منظور راحتی استفاده از روش کلدال ضریب تبدیل نیتروژن به پروتئین کلدال بسیاری از مواد غذایی با توجه به ترکیب اسیدهای آمینه آنها محاسبه شده است و محققین به منظور محاسبه کمی پروتئین به روش کلدال از این فاکتورها استفاده میکنند به عنوان مثال این فاکتور برای شیر، گوشت گوساله و ماهی، گندم به ترتیب 6/02، 5/72، 5/82، 5/73 در نظر گرفته شده است
به منظور بالا بردن میزان دقت و حساسیت روش کلدال نیاز است. فاکتور پروتئین کلدال با توجه به میزان اسیدهای آمینه همان ماده غذایی مورد آزمایش، محاسبه و مورد استفاده قرار گیرد - . - Benedict, 1985 تا به امروز چندین نرمافزار کامپیوتری در زمینه پروتئینها تحت عنوان های Anthepro و Winpep به منظور تعیین توالی اسیدهای آمینه پروتئین ها و نرمافزار PSAAM، جهت مدل سازی سه بعدی پروتئین ها عرضه شده است.
-2 مواد و روشها
1-2 طراحی و برنامه نویسی نرم افزار
این برنامه کاربردی توسط نرم افزار برنامه نویسی Visual Basic 6.0 در 4500 خط برنامه نویسی، نوشته شد و تحت محیط ویندوز قابل استفاده است. این نرم افزار به صورتی طراحی شده است که تنها با وارد کردن میلیگرم بر گرم نمونه هر 21 اسید آمینه حاصل از آنالیز کروماتوگرافی و یا تعداد اسید های آمینه موجود در نمونه و یا حتی درصد اسیدهای آمینه تشکیل دهنده پروتئین در جای مشخص شده، می تواند فاکتور تبدیل نیتروژن به پروتئین آن را با سرعت پردازش 0/001 ثانیه مشخص نماید.
2-2 آنالیز اسیدهای آمینه توسط کروماتوگرفی مایع با کارایی بالا 1-2-2 هیدرو لیز اسیدی : ابتدا 100 میلی گرم از هر نمونه خشک ژلاتین را در لوله آزمایش در پوش دار ریخته و به آن 7/5 میلی لیتر اسید هیدروکلریدریک 6 نرمال اضافه شد برای تهیه اسید هیدرو کلریدریک 6 نرمال از اسید هیدروکلریدریک 37 درصد استفاده شد بدین صورت که 49/75 میلی لیتر از این اسید را در بالن ژوژه ریخته و به حجم 100 میلی لیتر می رسانیم. سپس نمونه ها را در آون 110 درجه سانتیگراد به مدت 22 ساعت انکوبه شد و در انتها هر نمونه به حجم 25 میلی لیتر رسید
2-2-2 مشتق سازی:
10 میکرولیتر از هر نمونه ژلاتین رقیق شده را درون ویال های کوچک ریخته شد و در آون تحت خلاء با دمای 50 درجه سانتیگراد گذاشته شد تا کاملاً خشک شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول بافر تهیه شده طبق دستور عمل زیرا به هر ویال - دقیقاً بر روی قسمت خشک شده - اضافه گردید.
مواد تشکیل دهنده محلول بافر:
- 5 میلی لیتر استو نیتریل
- 2/5 میلی لیتر پیریدین
- 1/5 میلی لیتر آب مقطر مخصوص کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
- 1 میلی لیتر تری اتیل آمین
سپس مجدداً ویالها را در آون تحت خلاء گذاشته تا کاملاً خشک شود و محلول بافر تبخیر شود. دوباره 100 میکرولیتر از بافر تهیه شده و 5 میکرولیتر فنیل ایزوتیوسیونات در زیر هود به آن اضافه گردید و به مدت 5 دقیقه ورتکس شد سپس درب هر ویال را باز کرده و به مدت 2 ساعت درون آون تحت خلا با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. به صورتی که محلول بافر و ایزوتیوسیونات کاملا تبخیر شود. در این حالت لکه زرد رنگی در انتهای ویال دیده می شود. در ادامه 250 میکرولیتر آب مقطر مخصوص کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به هر ویال اضافه گردید و به مدت 5 دقیقه ورتکس شد در این مرحله محلولی شیری رنگ بوجود می آید و در انتها قبل از تزریق به دستگاه به مدت 7 دقیقه سانتریفوژ با دور بالا 12000 - دور - انجام گرفت تا لکه ای زرد رنگ تشکیل گردید. همچنین این عمل همزمان برای نمونه شاهد که مجموعه ای از 21 اسید آمینه تشکیل دهنده پروتئین است انجام گرفت
3 -2- 2 تزریق به دستگاه کروماتوگرافی با کارایی بالا :
- HPLC - محلول استاندارد اسیدهای آمینه و نمونه های ژلاتین توسط دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا - KNAUER - ساخت کشور آلمان با پمپ - Smartline-1000 - با لوپ 20 میکرولیتری و با استفاده از ستون &18 - 4.6×250PP'5 P - در دمای 27 درجه سانتیگراد و با سرعت جریان 1 میلی لیتر بر دقیقه آنالیز گردید.
-3 نتایج و بحث
جدول - 1 ترکیب اسیدهای آمینه شش نمونه ژلاتین بر حسب میلیگرم
شکل - 1 منحنی استاندارد مجموع اسیدهای آمینه حاصل از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
