بخشی از مقاله
چکیده
این تحقیق در راستای دستیابی به یک پروتکل مناسب بهمنظور تکثیر انبوه از طریق ریز ازدیادی ژنوتیپهای مختلف به با بررسی پژوهشهای انجام شده در این زمینه صورت گرفت. در این بررسی محیط های کشت MS،2 QL 1تغییریافته وNN3 و تاثیرکلسیم، آگار، اکسین و TDZ مورد ارزیابی قرار گرفتند. درمحیطMS کاهش در رشد و افزایش درسطح کلسیم بویژه در 30 میلی مول بیشتر بود.
افزایش کلسیم در محیط کشت، کاهش در رشد، نکروزه شدن نوک ساقه و شیشه ای شدن را باعث شد. محیط کشت QL تغییریافته بهترین نتیجه را در رشد ژنوتیپهای KVD4 ، NB2، PH2 و پایه quince C داشت. حداکثر باززایی ساقه در محیط کشت NN بود. مدارک مهمی وجود دارد که TDZ شاید قوی ترین سیتوکینینی باشد که در حال حاضر برای کشت بافت بسیاری از گونه های چوبی موجود است.
مقدمه
درخت به با نام علمی - cydonia oblonga - پس از سیب و گلابی در رده سوم اهمیت در میوه های دانه دار است و متعلق به تیره Rosaceae می باشد. به یک درخت کوچک است که تحت هوای گرم کشت می شود و ارتفاع آن تا 8 متر است. نام جنس cydonia از سواحل شمال غربی کرت و یونان گرفته شده است
درخت به از طریق پاجوش، قلمه، خوابانیدن و پیوند قابل تکثیر است. این روشهای ازدیاد علیرغم وابسته بودن به فصول خاصی از سال، نیازمند صرف زمان طولانی، تسهیلات خزانه ای و مهارت های فردی ویژه می باشد
از طرفی گزارش شده است ریشه زایی قلمه های چوب سخت یا نرم به همانند گلابی با وجود اعمال تیمارهای هورمونی مختلف به سختی صورت می گیرد و ضروری است نسبت به ازدیاد این ارقام به صورت گروهی اقدام شود. با کشت سریع غیر جنسی و ریز افزایی، تکثیر انبوه گیاهان در حداقل زمان و فضای ممکن می باشد. این روش برای ازدیاد ارقام اصلاح شده و یا ارقام حاصل از تکنیک های بیوتکنولوژی مانند رقم مقاوم به بیماری به کار میرود، در نتیجه امکان تولید نهال در تمام طول سال، در کوتاه ترین زمان و در کمترین فضای رشد امکان پذیر است و به طبع آن هزینه تولید نهال کاهش می یابد
افزایش درختان میوه ازطریق سنتی به دلایلی مثل هتروزیگوسیتی، پلی پلوئیدی، چرخه های طولانی زایشی و فرآیندهای طولانی آزمایشی درمزرعه سخت و زمان بر است
ریز ازدیادی یا کشت بافت یک سیستم تثبیت شده از تکثیر سریع برای تولید مواد هموژن برای صنعت باغبانی است. کاربردهای دیگر کشت بافت شامل جنین زایی سوماتیکی، هیبریداسیون سوماتیکی، حذف ویروس و ... میباشد. توسعه برنامه های کشت بافت نیازمند یک فرآیند سخت است که با دانش ویژگی های داخلی تکثیرگیاه، گونه ها و نوع ژن آغاز می گردد و شامل بهینه سازی عوامل فیزیکی، شیمیایی ومحیطی رشد است
یک ریز نمونه می تواند به چندین هزارگیاه در زمان کوتاه تبدیل شود. در بسیاری از گونه ها ریز نمونه ی ارگانهای مختلف تفاوت هایی در میزان رشد و باز تولید نشان می دهد، در حالی که تعدادی اصلا رشد نمی کنند. بنابراین انتخاب ریزنمونه ی مناسب مهم است. ریزنمونه ای که بیشتر از همه استفاده میشود مریستم نوک ساقه است علاوه بر نوک ساقه، برگ پریموردیا ، جوانه جانبی وبخشی از ارگان های ذخیره1درگیاهان پیازی، سلول های مریستماتیک دارند. علیرغم تلاش های فوق العاده دقیق در امر نهال های در حال رشد در شرایط آزمایشگاهی و پیشرفت های ایجاد شده در کشت بافت گیاه، کاربرد این تکنیک هنوز تحت تاثیر انواع مشکلات فیزیولوژیکی و رشد از جمله رشد غیر طبیعی تا افزایش ناپایداری و تنوع ژنتیکی می باشد.
چندین بررسی اخیر هنوز مشکلات ریز ازدیادی مرتبط با جنبه های فیزیولوژیکی و رشدی مثل نکروزهای نوک ساقه - - Bairu et al., 2009 رشد ناهنجار و غیر نرمال - Iliev and Kitin, 2011 - 2، تکثیر بافت و جوان شدن3 طولانی مدت - Brand, 2011 - و شیشه ای شدنDe Klerk and. Marinova, 1997 - 4 - گزارش شده است. آلودگی های محیط کشت و آزمایشگاه از جمله موانع مهم بر سر راه کشت بافت است. همه کاربرانی که در زمینه کشت سلول، بافت و اندام کار می کنند به این نتیجه رسیده اندکه هیچ مشکلی به اهمیت زیان ناشی از آلودگی در محیط های کشت وجود ندارد. عواملی مثل باکتریها، قارچها، مخمر، ویروس و حشرات باعث ایجاد این آلودگی ها است
انواع روش های کشت :
-1نوک ساقه ها از گیاهان در حال رشد درخت به تهیه شد وطبق مراحل زیر استریلیزه شد. دریک محلول %0,25 هیپوکلوریت سدیم 10% - کلروکس - به همراه 0,1% توئین20 برای 4 دقیقه با مالش ملایم، و سپس 4 دقیقه بدون مالش و سه دفعه آبکشی در آب مقطر استریل و سپس نوک ساقه به بلندی 2 سانتیمتر در زمان شستشوی نهایی بریده شد.
برای شروع کشت از 3 محیط کشت MS، محیط با غلظت کلسیم بالا - 30میلی مول - و محیط کشت شامل 18 میلی مول کلسیم استفاده شد. در همه محیط ها از 555 میکرو مول میواینوسیتول ، 1/2 میکرو مول تیامین، 87/6میکرو مول ساکارز 5 میکرومول BAو %1/2 آگار گیاهی، استفاده شد. pH محیط کشت در محدوده ی 5/7 تا5/8 با - HCIهیدروکلرید - یا KOH - هیدروکسید پتاسیم - پیش از اتوکلاو برای 15 دقیقه در دمای 121 سانتی گراد تنظیم شد.
برای آغاز کشت و همه مطالعات بعدی، ریز نمونه ها در محیط 20ml در تیوپ های 150×25میلیمتر قرار داده شدند. همه تیوپ ها با کلاهک های پلی پرولین بسته شدند و با فیلم پلی وینیل کلراید برای کاهش خشک شدن محیط کشت مهر و موم شدند. کشت ها تحت 16 ساعت تابش نور با فلوروسنت سفید - حدود 60ʽmol- - 1m-2 در 1 25 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. ساقه ها در آزمایشگاه به بلندی حدود 1,5 سانتیمتر بریده شدند و2بار در وقفه های ماهانه درمحیط های کشت تازه با همان ترکیبی که در ابتدا تعیین شد تحت کشت قرار گرفتند
-2درخت به - رقم اصفهان - مشهور به KVD2 ، از مرکز تحقیقات باغبانی در ایران، کرج موسسه بهبود دانه وگیاه تهیه شد. ساقه های آزمایشگاهی توسط محققین در موسسه تحقیق بیوتکنولوژی کشاورزی ایران5 تثبیت شدند. ساقه های ازمایشگاهی در محیطMS حاوی 0/5 میکرومول IBA ، 1/66 میکرومول GA3 ، 100mgl-1 فلوروگلوسینول و 3% ساکارز و 7 gr l-1 آگار گیاهی تکثیر شد..
pH روی 5/8 با استفاده از سدیم هیدروکسید 0/1 - NaOH - نرمال یا اسید هیدروکلرید - 0/1 - Hclنرمال پیش از افزودن آگار گیاهی تنظیم شد. تمامی محیط ها برای 15 دقیقه در 6 Kpa1/2 فشار و 121 درجه سانتیگراد اتوکلاو شدند. کشت ها را در دمای 2 24± درجه سانتیگراد در یک دوره نوری 24 ساعت در شدت نور m-2 s-1 mol µ 60 تهیه شده با نور لامپ ها ی فلوروسنت پرورش دادند و هر 40 روز درمحیط تازه تحت کشت قرار دادند
-3 قطعات گرهای چهار رقم امید بخش به شامل KVD4، NB2، PH2 و پایه quince C در کنار رقم به اصفهان - KVD3 - به عنوان شاهد انتخاب شد و بعد از انتقال به آزمایشگاه، برگهای آنها حذف شده و به منظور ضدعفونی سطحی، ابتدا نمونههای گیاهی در اتانول %70 حجمی به مدت 30 ثانیه غوطهور و سپس 20دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم %2 وزنی خیسانده و در انتها سه مرتبه با آب مقطر استریل شده آبکشی شدند. سپس نمونهها را تفکیک کرده و در محیط کاملا استریل با وسایل و لوازم استریل شده، به قطعات کوچک 8 تا 12 میلیمتر تقسیم شدند و در محیطهای رشد پایه مورد استفاده شامل: MS ، QL و QL تغییریافته همراه با غلظتهای مختلف BAP، GA3 که پس از افزودن 3 درصد ساکارز و 0/6 درصد آگار در دمای 120 درجه سانتیگراد و فشار 1/2 اتمسفر به مدت 20 دقیقه در اتوکلاو استریل و سپس کشت داده شدند. لازم به ذکر است pH محیطها قبل از افزودن آگار درحد 5/7 تنظیم شده است.
GA3با استفاده از فیلترهای 0/2 میکرومتر به محیطهای رشد اضافه شد . - Abdollahi et al., 2006 - سپس نمونههای کشت شده در شرایط مطلوب در اتاق کشت نگهداری شدند. شرایط اتاق رشد عبارت بوده از دمای 25 درجه سانتیگراد و دورهی نوری 16 ساعت که با لامپهای فلورسنت 40 وات تامین می شود. در این آزمایش صفات رشدی در 4 تکرار بر اساس رشد طولی ساقه در فواصل زمانی 30 روز بررسی شد.
دماهای بهینه برای کشت بافت گیاه توسط چندین محقق بررسی شد و یک محدوده از 20 تا 27 درجه سانتیگراد بهترین دمای به کار گرفته شده برآورد شد. دمای بهینه بستگی به گونه های گیاهی دارد
شدت نور و کیفیت نور عوامل حساس و مهمی در فتوسنتز هستند. کیفیت نور می تواند درکشت آزمایشگاهی تاثیر بگذارد، زیرا نور قرمز ومادون قرمز وآبی دربسیاری ازپاسخ های فیزیولوژیکی دخیل است. مشخص شده که نورآبی درکشت های آزمایشگاهی محرک - Ward and vance., 1967 - و مانع - - Siebert et al., 1975 است.
ریشه زدن ریز نمونه ها زمانی که ازکشت های رشد یافته تحت نورمادون قرمز گرفته شدند تقویت شد . - Economou et al., 1984 - با ظهورمنابع نورتک رنگ کیفیت بالا، مثل 1LED واضح است که پیشرفت زیادی در فهم نقش کیفیت نور برای کشت های آزمایشگاهی صورت گرفته است
به علاوه 1LEDمی تواند برای ریز ازدیادی به خاطر ویژگی های کارآمدتبدیل انرژی بالا با تولید انرژی گرمایی پائین مطلوب باشد - . - Jordan et al.,2001 در طول مرحله تکثیر، ریزنمونه ها باید در نبود ریشه ها زنده بماند و از مواد مصنوعی حاوی سطح بالای نمک وتنظیم کننده رشد مازاد استفاده کند.
سیتوکینین ترکیبی به تنهایی یا در ترکیب با یک مقدارکم از اکسین به کارمی رود. سیتوکینین ها به عنوان محرک های شاخه زایی به کارمی رود هم چنین در مقدارهای بیشتر برای باز تولیدی جوانه های جدید به کار می رود. اکسین ها طویل شدن سلولی را تحریک می کنند - Mineo, L. 1990 - و برای ریشه زایی نیز به کار می رود.
2TDZ
جزو فعال ترین مواد سیتوکینین مانند برای کشت بافت گیاه است. این ماده ریز ازدیادی را در بسیاری از گونه ها ی چوبی سرسخت تسهیل می کند.TDZ یکی از چندین نیتروژن جایگزین است که برای فعالیت سیتوکینین مورد بررسی قرار گرفته است. فعال ترین این ترکیب ها TDZ ، - mok., 1980 - DPU ، و - Fetlman et al., 1987 - CPPU هستند.
بحث و بررسی
مشکلی که ممکن است در طول ریز ازدیادی وجود داشته باشد، تغییر شکل است. این تغییر شکل به عنوان ادغام ریشه ها به خاطر انحراف از فرآیندهای نرمال مریستمی توصیف می شود. از نظر ریخت شناسی، صاف شدن غیر طبیعی ریشه ها به خاطر شکست شاخه های جانبی جدا شده از ریشه اصلی درطول رشد است. آی لیو و کیتین - 2011 - ، منشاء شکل شناسی و آناتومی شیشه ای شدن را با تاکید ویژه بر گیاهان کشت شده در آزمایشگاه بررسی کردند.
مشکل فیزیولوژیکی مهم دیگر، شیشه ای شدن است . - Debergh et al., 1992 - که متشکل از شکل گیری بافت هایی با یک درصد افزایش یافته از آب به خاطرفشار شدید است که بر یک حلقه در تشکیل اتیلن در ظرف کشت وارد می شود
