بخشی از مقاله
مقدمه
فسفر یکی از عناصر غذایی مهم براي گیاهان میباشد و در خاکها به دو شکل آلی و معدنی به مقدار فراوان و در محدوده 400- 1200 mg kg-1 حضور دارد امالظتغ فسفات محلول در خاك معمولاً خیلی پایین است و در سطح 1 mg kg-1 یا کمتر میباشد
توجه به سازوکار زیستی و میکروبی در تامین فسفر مورد نیاز گیاهان زمانی مشخص میشود که بدانیم خاك از نظر منابع فسفات فقیر نمیباشد، به عنوان نمونه تريکلسیم فسفات شکل غالب فسفات در شرایط قلیایی بوده و همچنین فسفاتهاي آهن و آلومینیم در خاکهاي اسیدي به فراوانی یافت میشود اما قابل استفاده گیاه نیستند. بعلاوه 75 تا %90 فسفات که در قالب کود شیمیایی به خاك اضافه میشود تشکیل رسوب میدهد و از دسترس گیاه خارج میشود، این موضوع به واکنشپذیري بسیار بالاي یون ارتوفسفات با کاتیونهاي فلزي از قبیل Al3+ و Fe 3+ در شرایط خاكهاي اسیدي و با یون Ca2+ در خاكهاي خنثی تا آهکی برمیگردد.
مدارکی مبنی بر نقش ریزسازوارههاي ریزوسفري در انحلال فسفات معدنی به سال 1903 برمیگردد . - Illmer and Schinner , 1992 - ریزسازوارهها از طریق معدنی کردن فسفر آلی و انحلال فسفاتهاي رسوب یافته، فراهمسازي فسفر براي گیاهان را افزایش میدهند
این دسته از ریزسازوارهها گرچه فسفر را در ساختار سلولی خود به خدمت میگیرند، ولی بخشی از آن که در محیط آزاد شده است در اختیار گیاه قرار میگیرد. در میان فلور میکروبی خاك برخی از باکتریها داراي قابلیت ویژهاي در انحلال فسفات معدنی و معدنی نمودن فسفات آلی هستند که این رفتار آنها با سازوکار تولید اسیدهاي آلی و آنزیمهاي فسفاتاز در ارتباط میباشد. گونههایی از جنس Pseudomonas ، Bacillus ، Pantoea و Rhizobium از قويترین حلکنندگان فسفات به شمار میآیند.
جداسازي و بررسی کارایی انحلال فسفات آنها به عنوان یک راهکار جایگزین استفاده از کودهاي شیمیایی فسفاته میتواند مورد توجه قرار گیرد. به صورتیکه باکتريهاي حل کننده فسفات از سال 1950 به عنوان کود زیستی مورد استفاده قرار میگیرند. بر این اساس در این مطالعه اقدام به جداسازي باکتریهاي حلکننده فسفات در محیطهاي غربالگري حاوي منابع فسفات آلی و معدنی نامحلول شده است، تا ضمن جداسازي با بررسی کارایی آنها در محیط جامد و مایع، ایزولههاي کارامد براي شناسایی مولکولی نامزد شوند.
مواد و روشها
براي این منظور تعداد 24 نمونه خاك از شرایط اقلیمی متفاوت - نیمهمرطوب و نیمه خشک - در اراضی
تحت کشت گیاهان لگوم، غلات و زمین عاري از کشت، از اعماق 0-25 سانتیمتر نمونه برداري شد. بعد از نمونهبرداري از خاکهاي مختلف، روش مرسوم در جداسازي اولیه این دسته از باکتريها که استفاده از منابع فسفاته معدنی و آلی کممحلول یا نامحلول در محیط کشتهاي جامدمی باشد، مورد استفاده قرار گرفت
بعد از غربالگري اولیه و انتخاب ایزولههاي داراي هاله شفاف در محیط معدنی یا ایزولههاي با فنوتیپ آبی در محیط آلی، مقایسه همزمان آنها به روش کشت نقطه اي انجام پذیرفت - مطابق شکل - 1 تا ایزولههاي برتر براي بررسی در محیط کشت مایع مورد استفاده قرار گیرند
در محیطهاي مایع حاوي فسفر آلی - فیتات - علاوه بر سنجش آزادسازي فسفر به روش پایش رنگ زرد - روش کمی - از روش کیفی دیگري به صورت همزمان استفاده شد که به معرف واد - Wade’s reagent - معروف است. در این روش اگر فیتات هنوز در باقیمانده کشت میکروبی موجود باشد با آهن موجود در معرف Wades پیوند یافته و محیط به صورت بیرنگ باقی خواهد ماند - مطابق شکل . - 2 اما اگر فیتات با هر یک از میکروارگانیسم هاي موجود در نمونه مصرف شود، آهن موجود در معرف در پیوند با اسید سولفوسالیسیلیک - sulfosalicylic acid - باقی میماند و تولید رنگ صورتی - مولدان فیتاز، امتیازدهی مثبت - خواهد کرد
قابل ذکر است که باکتریهاي منتخب در دو محیط آلی و معدنی جامد، هم در محیط معدنی مایع و هم در محیط آلی مایع مورد ارزیابی قرار گرفتند. در ادامه در مورد ایزولههاي برتر اقدام به شناسایی مولکولی شد که براي این منظور از آغازگرهاي 27F و 1492R استفاده شد، جزییات بیشتر این روش بر اساس منبع - Sarikhani et al., 2013b - صورت پذیرفت. در شکل 3 عکس ژل الکتروفورز مربوط به تکثیر قطعه 16S rDNA با اندازه نزدیک به 1.5kb قابل مشاهده میباشد.
شکل -1 مراحل جداسازي و غربالگري حل کنندگان فسفات - سمت راست - در محیط داراي فسفر آلی - با ویژگی تولید کلنی آبی - و در محیط داراي فسفر معدنی - با ویژگی تولید هاله شفاف - - ارزیابی حلکنندگی فسفات به صورت کشت نقطهاي - سمت چپ -
شکل -2 استفاده از معرف وادز جهت تعقیب حضور فیتات - عدم فعالیت فیتازي - یا عدم حضور فیتات - فعالیت فیتازي - به ترتیب با تولید رنگ سفید و صورتی.
شکل-3 تکثیر قطعه DNA رمزکننده 16S rRNA باکتریهاي منتخب جهت شناسایی مولکولی
نتایج و بحث
در این پژوهش از 24 نمونه خاك به ترتیب در محیط هاي Sperber آلی و معدنی غربالگري انجام شد و بر اساس تولید کلنی هاي آبی در محیط آلی و هاله شفاف در محیط معدنی - مطابق شکل 1 سمت راست - به ترتیب 97 و 43 ایزوله جداسازي شد. در گام بعدي به منظور مقایسه همزمان ایزوله هاي فوق در 3 تکرار کشت نقطه اي آنها در محیط هاي آلی و معدنی انجام پذیرفت - شکل 1 سمت چپ - .
در کشت نقطه اي انجام شده ملاك انتخاب ایزوله هاي برتر در محیط معدنی تولید هاله شفاف بیشتر بود که بر این اساس نسبت قطر هاله به قطر کلنی مد نظر قرار گرفت و باکتریهاي با نسبت بالاي 2 انتخاب شدند، در نتیجه از 43 ایزوله اولیه 16 ایزوله انتخاب شدند . در محیط آلی بر اساس شد ت رنگ آبی که به صورت کیفی امتیازدهی شده بود 3 - ، 2، 1 و 0 به ترتیب آبی پررنگ، آبی متوسط، کمرنگ و بی رنگ - از 97 ایزوله اولیه، 52 ایزوله با شدت رنگ بالاي 2 انتخاب شدند.
سپس در مرحله بعد ارزیابی آزادسازي فسفر از منابع فسفات معدنی - تريکلسیم فسفات - و آلی - داراي فیتات یا - IHP در محیط هاي مایع به ترتیب براي 16 و 52 ایزوله جداسازي شده از محیطهاي Sperber معدنی و آلی جامد انجام گرفت. با توجه به حجم زیاد ایزولههاي مورد بررسی، در این نوشتار سعی خواهد شد به برخی از اطلاعات قابل توجه در مورد ایزوله هاي نامزد شده نهایی اکتفا شود - جدول . - 1 ایزوله هاي نامزد براي شناسایی مولکولی به ترتیب شامل C1-1O، C4-5O، C9-1O، C13-1O و C16-2O بودند که شناسایی این جدایهها در حال تکمیل شدن میباشد.
جدول-1 ویژگیهاي اندازهگیري شده ایزولههاي برتر در این آزمایش
همچنانکه در جدول 1 موجود می باشد تاکید ما دسترسی به سویه هاي باکتریایی بود که علاوه بر داشتن فعالیت فسفاتازي بالا - یعنی قدرت معدنی نمودن منابع فسفر آلی - داراي توان انحلال فسفات معدنی نیز باشد به این منظور پایش هاي همزمان در دو محیط آلی و معدنی براي تمام ایزوله هاي جداسازي شده انجام پذیرفت . و از آنجاییکه ویژگی حل کنندگی فسفات برخی از باکتریها پایداري لازم را ندارد، دوام و پایداري توان حلکنندگی باکتریها با کشتهاي مجدد مورد آزمایش قرار گرفت.
در مطالعات انجام شده به منظور جداسازي و شناسایی باکتریهاي حل کننده فسفات روشهاي متنوعی با رعایت برخی اصول کلی به کار گرفته شده است، با توجه به آنها و هدفی که در این مطالعه دنبال میشد از سوبستراي رنگزا - BCIP - در حضور منبع آلی IHP براي جداسازي استفاده شد
