بخشی از مقاله
چکیده
سینامیل الكل دهیدروژناز - CAD - آنزيمي است كه در مراحل پاياني بیوسنتز منومرهاي لیگنین دخالت دارد. با پلیمريزاسیون اين منومرها، لیگنین در ديواره ثانويه سلول ها رسوب كرده و ضمن فراهم آوردن حمايت مكانیكي، مانعي در برابر تنش هاي زيستي و غیر زيستي خواهد بود. اثر نمك NaCl بر فعالیت آنزيم CAD و رسوب لیگنین طي تكوين میانگره هاي آلوروپوس لیتورالیس - - Aeluropus littoralis كه هالوفیتي از گرامینه ها است مطالعه شد .
نتايج نشان داد كه تنش شوري سبب افزايش فعالیت آنزيم CAD در هر سه موقعیت میانگره اي شده اما به طور كلي فعالیت آنزيم در میانگره هاي راسي نسبت به قاعده اي بیشتر است. محتوي لیگنین كل به طور كامال محسوسي تحت تنش نمك و طي تكوين میانگره ها از راس تا قاعده افزايش يافت. مطالعه حاضر بیان مي كند كه تغییرات فعالیت آنزيم CAD و لیگنیني شدن تحت تنش شوري هم راستا بوده و به نظر مي رسد كه افزايش فعالیت آنزيم هاي موثر در بیوسنتز لیگنین از جمله CAD و به دنبال آن تجمع بیشتر لیگنین در ديواره هاي سلولي مي تواند يك استراتژي براي تحمل بهتر شوري در اين هالوفیت باشد.
مقدمه
شوري آب و خاک تهديد جدي براي زمین هاي كشاورزي است. تنش نمك رشد و نمو گیاه را تحت تاثیر قرار داده و سبب كاهش كیفیت و كمیت محصوالت و بنابراين كاهش تولیدات كشاورزي مي شود.]13[ يكي از راههاي مبارزه با اين مشكل، شناسايي مكانیسم هاي مقاومت در گیاهان مقاوم و به دنبال آن مقاوم سازي گیاهان زراعي است. لیگنین پلیمري از تركیبات فنلي است كه در ديواره سلول هاي گیاهي رسوب كرده و ضمن فراهم آوردن حمايت مكانیكي و استحكامي براي بافت هاي گیاهي، نقش مهمي را در رشد و نمو گیاه بازي مي كند.
لیگنین همچنین به عنوان سد مكانیكي در برابر انواع تنش هاي زيستي و غیر زيستي شناخته شده است.]9[ در سلول هاي گیاهان تنباكو تیمار شده با بور اضافي مقادير باالتري از لیگنین نسبت به گیاهان تحت شرايط كنترل مشاهده شد.]4[ در Phaseolus vulgaris تحت تنش نمك لیگنیني شدن بافت هاي آوندي ريشه افزايش مي يابد.]2[ بیوسنتز لیگنین شامل يك سري وقايع متابولیكي منظم و هماهنگ است كه تعداد زيادي آنزيم در اين مسیر دخالت دارند.
سینامیل الكل دهیدروژناز - CAD, EC 1.1.1.195 - از آنزيم هاي مهم در بیوسنتز پیش سازهاي لیگنین است كه مرحله پاياني بیوسنتز منومر هاي لیگنین يعني تبديل برگشت پذير سینامیل آلدئید ها را به الكل هاي مربوطه يا منولیگنین ها كاتالیز مي كند. CAD نه تنها آنزيمي موثر در بیوسنتز لیگنین است بلكه نقش مهمي را در مكانیسم هاي مقاومت در برابر انواع تنش ها ارائه مي كند. در آرابیدوپسیس تالیانا تحت تنش هاي مختلفي چون عوامل بیماريزا، كمبود آب و آسیب ديدگي برگ ها، افزايشي در بیان ژن هاي موثر در لیگنیني شدن از جمله ژن كد كننده آنزيم CAD ديده شد.
در واقع CAD يكي از اهداف دستكاري ژنتیكي براي تغییر در مقدار و تركیب لیگنین به شمار مي رود.]11[ آلوروپوس لیتورالیس - Aeluropus littoralis. Parl - هالوفیتي چند ساله از تیره Poaceae و بومي ايران است. اين گیاه كه در زمین هاي شور و ساحلي و بیابانها با میزان بارندگي كم رشد مي كند از لحاظ فتوسنتزي از تیپ C4 بوده و قادر به تحمل سطوح باالي شوري و همچنین تحمل خشكي و گرما نیز است.
با داشتن چنین ويژگي هايي آلوروپوس به عنوان يك گیاه مدل و منبع ژنتیكي غني براي درک مكانیسم هاي مقاومت در برابر تنش هايي چون شوري، خشكي و گرما شناخته شده و در بهبود مقاومت در گیاهان زراعي و مهم از نظر اقتصادي مي تواند مفید باشد .]6[ در سال 2001 انتقال صفت تحمل به شوري از A. littoralis به گندم نان با استفاده از روش دو رگ گیري سوماتیك نامتقارن، توسط Wei و همكاران ]12[ گزارش شد. همچنین انتقال ژن NHX جدا شده از آلوروپوس لیتورالیس به گیاهان تنباكو سبب افزايش تحمل شوري در گیاهان تراريخت شد .]5[
درک فرايند لیگنیني شدن و فعالیت آنزيم هاي مرتبط با آن در آلوروپوس لیتورالیس به عنوان يك گیاه مدل مي تواند اطالعات مفیدي را براي كنترل متابولیكي لیگنیني شدن و به دنبال آن دستكاري ويژگي هاي مقاومت در برابر تنش هاي مختلف از جمله شوري فراهم آورد. بدين منظور در اين پژوهش ، به مطالعه تغییرات در محتوي لیگنین كل و ارتباط آن با فعالیت آنزيم CAD تحت تنش نمك NaCl طي مراحل مختلف بلوغ میانگر ه ها پرداخته شد.
مواد و روش ها
نمونه هاي گیاهي و شرايط رشد: بذرهاي گیاه آلوروپوس لیتورالیس از شركت پاكان بذر اصفهان تهیه و بعد از ضدعفوني سطحي در گلدان هاي حاوي ماسه شسته شده با اسید، كاشته شدند. گلدان ها در گلخانه اي در پژوهشكده ژنتیك و زيست فناوري طبرستان با رطوبت نسبي 40 تا 60 درصد، دوره نوري 15 ساعت روشنايي و 10 ساعت تاريكي و دماي حداقل 23 و حداكثر 22 درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
گلدان ها براساس نیاز با محلول هوگلند آبیاري شده و بعد از 54 روز با محلول هاي هوگلند محتوي 0، 200 و 500 میلي موالر NaCl تیمار شدند. میانگره هاي راسي - اولین، I1 - ، میاني - چهارمین از راس، - I4 و تحتاني - هفتمین از راس، - I7 بعد از گذشت 14 روز از اعمال تنش برداشت شده و بالفاصله در فريزر -20 ذخیره شدند. نمونه ها براي سنجش لیگنین به مدت يك هفته در دماي 40 درجه خشك شدند و بعد از پودر شدن در ديسكاتور ذخیره شدند.
سنجش فعالیت آنزيم : CAD فعالیت اين آنزيم بر اساس روش Halpin و همكاران ]2[ با اندكي تغییرات انجام شد. مخلوط واكنش شامل 200 میكرولیتر بافرتريس 0/1 موالر با اسیديته 2/2 ، 40 میكرولیتر عصاره آنزيمي، 100 میكرولیتر NADP+ و40 میكرولیتر كونیفريل الكل 2 میلي موالر بود. فعالیت آنزيم CAD با اكسیداسیون كونیفريل الكل در 30˚C و تشكیل كونیفرآلدئید و جذب آن در طول موج 390 نانومتر تعیین شد.
سنجش لیگنین : محتوي لیگنین كل به روش استیل برمايد تعیین شد.]4[ ابتدا نمونه هاي پودر شده میانگره ها به طور متوالي با آب مقطر، اتانل، مخلوط كلروفرم و متانل و در نهايت استن شسته شده تا ديواره سلولي استخراج شود. به2/4 میلي لیتر مخلوط حاوي 24 درصد استیل برمايد در اسید استیك و 0/1 میلي لیتر پركلريك اسید 00٪ ، 5 میلي گرم از پودر ديواره سلولي خشك شده اضافه شد و بعد از قرار دادن در 00˚C به مدت 30 دقیقه ، هر 10 دقیقه يك بار تكان داده شد.
بعد از سرد كردن نمونه ها در آب يخ مخلوط حاصل به بالن ژوژه هاي 24 میلي لیتري حاوي 4 میلي لیتر 2 NaOH موالر و 6 میلي لیتر اسید استیك گالسیال اضافه شده و با اين اسید به حجم 24 میلي لیتر رسانده شدند. محتوي لیگنین با اندازه گیري جذب در طول موج 220 نانومتر و با استفاده از ضريب جذب ويژه - SAC=20.0g-1Lit Cm-1 - محاسبه شد روش هاي آماري: كلیه آزمايشات در سه تكرار مستقل و هر يك با حداقل 3 نمونه انجام شد. تحلیل داده ها و معني دار بودن اختالف بین آنها با تجزيه واريانس يك طرفه در سطح P≤ 0.05 در نرم افزار SPSS استفاده شد.
نتایج و بحث
به طور كلي نتايج اين مطالعه نشان داد كه فعالیت آنزيم CAD با افزايش غلظت NaCl افزايش مي يابد. همانگونه كه در تصوير 1 نشان داده مي شود در موقعیت هاي اولین و چهارمین میانگره I4 - و - I1 فعالیت اين آنزيم با افزايش غلظت NaCl از 0 تا 500 میلي موالر به طور معني داري - - P≤ 0.05 افزايش داشت. در میانگره هفتم - I7 - تفاوت معني داري بین غلظت 0 و 200 میلي موالر مشاهده نشد اما در 500 میلي موالر فعالیت آنزيم CAD افزايش يافت. اين نتايج همسو با ساير يافته ها، بیانگر دخالت آنزيم سینامیل الكل دهیدروژناز در مكانیسم هاي مقاومت تحت شرايط تنش زا است.]3[
از طرفي با افزايش سن و بلوغ میانگره ها فعالیت آنزيم CAD كاهش يافت كه اين كاهش در تیمار 200 و 500 میلي موالر NaCl كامال محسوس بوده، طوريكه باالترين فعالیت اين آنزيم در میانگره راسي و پايین ترين آن در میانگره قاعده اي مشاهده شد. به نظر مي رسد تنش نمك سبب القاء سريعتر فعالیت اين آنزيم شده چرا كه در تیمار هاي 200 و 500 میلي موالر NaCl در میانگره هاي راسي كه جوان هستند فعالیت اين آنزيم در باالترين سطح بوده اما در تیمار شاهد فعالیت CAD در میانگره میاني - - I4 از باالترين سطح برخوردار بود.
Morrison و همكاران ]10[ نشان دادند كه فعالیت CAD همراه با تشكیل ديواره ثانويه و تمايز بافتي شروع مي شود و در تمام زمان ها فعالیت آن به صورت بازي پتالي كاهش مي يابد و در بخش هاي راسي بیشتر از بخش هاي قاعده اي است. در واقع همانطور كه نتايج نشان مي دهد فعالیت آنزيم CAD به طور تكويني و طي بلوغ میانگره ها تنظیم مي شود.
افزايش معني داري - - P≤ 0.05 در میزان لیگنین كل همراه با افزايش غلظت نمك در هر سه موقعیت میانگره اي مشاهده شد - تصوير - 2 به جز میانگره چهارم كه تفاوت معني داري بین تیمار 0 و 200 میلي موالر NaCl مشاهده نشد. Aguayo و همكاران نیز در سال 2005 نشان دادند كه تنش نمك سبب افزايش لیگنین در عناصر گزيلمي ساقه گوجه فرنگي مي شود .]1[
همچنین در بسیاري از هالوفیت ها لیگنیني شدن به طور مثبت با شوري در ارتباط است. رسوب لیگنین در ديواره سلول سبب پايداري ودوام سلول شده و با افزايش فشار اسمزي مقابله مي كند .]0[ در هر سه تیمار رسوب لیگنین از میانگره هاي راسي I1 تا میانگره هاي تحتاني I7 افزايش معني داري را نشان داد كه بیانگر افزايش لیگنیني شدن همراه با تكوين میانگره ها است و اين مسئله كه تداخل لیگنین به درون ديواره سلولي به طور تكويني تنظیم مي شود.
در نتیجه، فعالیت آنزيم CAD در بخشهاي راسي و جوان ساقه كه لیگنیني شدن فعاالنه صورت مي گیرد نسبت به بخش هاي قاعده اي و مسن تر كه قبال به شدت لیگنیني شدند باالتر است. تحت تنش شوري تغییرات در فعالیت آنزيم CAD و رسوب لیگنین هم راستا بوده و افزايش معني داري در هر دو مورد مشاهده مي شود. در نهايت اينكه افزايش فعالیت CAD و در نتیجه آن افزايش لیگنین در ديواره سلولي مي تواند راهبردي براي تحمل بهتر شوري در هالوفیت آلوروپوس لیتورالیس باشد.
