مقاله مقایسه روشهای استخراج DNA از بافتهای ثابت شده در فرمالین

word قابل ویرایش
10 صفحه
دسته : اطلاعیه ها
12700 تومان
127,000 ریال – خرید و دانلود

چکیده
نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی، ضرورت جداسازی DNA با کیفیت عالی است. معمولا کیفیت DNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهائی که برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد میکنند سنجیده میشود. معمولا DNA استخراج شده از بلوک های پارافین و بافتهای فیکس شده در فرمالین بخاطر اثرات تخریبی وارد شده بر DNA، از کیفیت مطلوبی برخوردار نیستند. هدف از مطالعه، معرفی روش کارآمد در استخراج DNA از بافتهای نگهداری شده در فرمالین میباشد. جهت استخراج DNA از بافتهای نگهداری شده در فرمالین، دو پروتکل مختلف از کیت Bioneer و کیت طراحی شده General Genomic Extraction توسط نویسندگان مقاله مورد مقایسه قرار گرفتند. ارزیابی کمی و کیفی بر روی DNA های استخراج شده انجام گرفت. جهت تایید و ارزیابی DNA استخراج شده، واکنش PCR با پرایمرهای ژن بتاگلوبین بر روی تمام نمونه ها انجام شد. نتایج آزمایش کیفی و کمی نشان داد که DNA استخراج شده با استفاده از کیت General Genomic Extraction از کمیت و کیفیت مطلوبتری در مقایسه با کیت Bioneer برخوردار بود. میزان تکثیر نمونه ها با پرایمر بتاگلوبین، حاکی از غلظت و خلوص بیشتر DNA استخراج شده با کیت مذکور در مقایسه با کیت Bioneer بود. با توجه به آسیب ناشی از نگهداری بافت در فرمالین، کیت General Genomic Extraction کارایی بیشتری در استخراج DNA داشت. این روش میتواند برای استخراج DNA از بافتهای نگهداری شده در فرمالین و بلوکهای پارافین به صورت روتین در آزمایشات تحقیقاتی و بالینی مورد استفاده قرار گیرد.
واژگان کلیدی : استخراجDNA، بافت، فرمالین

مقدمه
پیشرفت در هر رشته علمی به در دسترس بودن تکنیکها و روشهای جدید و کارآمد در آن رشته بستگی دارد. در سالهای اخیر با پیشرفت روشهای سلولی و مولکولی، در اکثر آزمایشگاههای معتبر دنیا آزمایشاتی برای جدا کردنDNA ژنومی جهت پی بردن به سکانس و عملکرد آن انجام میشود . امـروزه مبـاحث ملکولی از اهمیت روز افزونی در بررسیهایعلوم زیستی برخوردار میباشد. استخراج DNA ژنومی خالص، پایدار و با کمیت و کیفیت مناسب، اولین و مهمترین گام در بسیاری از تحقیقات بیولوژیکی و ژنتیکی به ویژه در واکنش(RFLP)، تکنولوژی توالییابی ژنومی، تعیین ژنوتیپ افراد و شناسایی موتاسیونها میباشد .(۹)
نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی، ضرورت جداسازی DNA با کیفیت عالی است. معمولا کیفیت DNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهائی که برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد میکنند سنجیده میشود ۱)و .(۴
بسیاری از تحقیقات و مطالعات بالینی بر روی بافتهای ثابت شده در فرمالین و یا تهیه شده در قالب پارافین انجام میگیرد. از مزایای این نمونه ها میتوان به دسترسی آسان به گنجینه غنی از نمونه های بالینی در سالیان متوالی اشاره کرد. از سویی، جهت انجام تحقیقات مستمر و متوالی بستر مناسبی برای محققین فراهم میباشد.
به علت بزرگ بودن اندازه DNA ژنومی در پستانداران، روشهای استخراج DNA باید حداقل استرس مکانیکی را در طی استخراج ایجاد نمایند. از طرفی مشکلاتی نیز در خصوص استفاده از بافتهای ثابت شده نسبت به بافتهای تازه وجود دارد که از آن جمله میتوان به شکست DNA به قطعات کوچکتر و تجزیه شدن DNA اشاره کرد. بنابراین بهینه سازی و انتخاب روش استخراجی که کمترین آسیب را به DNA اینگونه بافتها برساند از اهمیت بالایی برخوردار است .(۶) یکی از مشکلات اساسی در استخراج DNA از اینگونه بافتها، وجود پیوندهای قوی بین پروتئین و DNA میباشد که بایستی در طیپروسه استخراج شکسته شوند .(۱۴) همواره مطالعات و تحقیقات متعددی در دنیا با هدف به حداقل رساندن آسیبهای DNA طی فرآیند استخراج در حال انجام است. در این راستا، روشها و کیتهای متعددی توسط شرکتهای مختلف عرضه میشوند که معمولا گرانقیمت هستند و بعضی حتی بازده مناسب ندارند. هدف از این تحقیق، بررسی مقایسهای کمیت و کیفیت DNA استخراج شده توسط کیت بیونیر (Bioneer) وکیتGeneral Genomic Extraction (GGE) ابداع شده توسط نویسندگان میباشد.
مواد و روش کار
نمونه برداری
در این مطالعه، نمونه های بافتی شامل آدنوکارسینومای کلورکتال قرار گرفته در فرمالین از بخش پاتولوژی بیمارستان امام خمینی تهیه شدند.
استخراج DNA بر اساس کیت Bioneer
استخراج DNA بر اساس روش کیت استخراج Bioneer (شرکت بیونیر کره جنوبی) انجام شد.
استخراج DNA بر اساس کیت General Genomic Extraction (GGE)
کلDNA سلولی بر طبق دستورالعمل کیت General(شرکت زیست دانش یاران)،استخراج شد. بطور خلاصه، ۰/۰۵ گرم از بافتهای مورد بررسی با تیغ اسکالپل خرد شدند و با بافر لیز کننده (Solution A) مخلوط شدند، سپس ۳۰ میکرولیتر پروتئیناز (۲۰ mg/ml ) K، به مخلوط اضافه شد و بمدت ۳ ساعت در دمای ۶۵˚C انکوبه شدند. میکروتیوپها هر ۱۵ دقیقه یکبار وارونه شدند. ۶ میکرولیتر از Binding Buffer (Solution B)به مخلوط اضافه شد و در ۱۲۰۰۰ rpm بمدت ۵ دقیقه سانتریوفوژ شدند. فاز رویی جدا شد. این مرحله دوباره تکرار شد. فاز رویی به میکروتیوپهای جدیدی انتقال یافت. ۶ میکرولیتر از بافر رسوب دهنده (Solution C) اضافهشد و بمدت ۲۰ دقیقه وارونه شدند. نمونه ها بمدت ۱۰ دقیقه در ۱۲۰۰۰ rpmسانتریوفوژ شدند و فاز رویی دور ریخته شد. رسوب DNA با بافر شستشو دهنده (Solution D) شستشو داده شد و سپس در ۱۲۰۰۰ rpm بمدت ۱۰ دقیقه در ۴˚C سانتریوفوژ شد. رسوب DNA در دمای ۳۷˚C خشک شدند.

بررسی کیفیت و کمیت DNA
برای بررسی کیفیت DNA های استخراج شده با دو روش، از ژل آگارز %۱ رنگ آمیزی شده با ژل رد استفاده شد. جهت تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از نانودراپ NanoDrop™ ND-2000 با اندازهگیری میزان جذب نوری ۲۶۰/۲۳۰ nm و ۲۶۰/۲۸۰ nm غلظت DNA، خلوص و آلودگی پروتئینی DNA استخراج شده تعیین شد.

PCR ژن بتاگلوبین به عنوان کنترل
واکنش PCR در حجم نهایی ۲۵ µl شامل، ۱۲/۵ µl بافر آمپلیکون، ۰/۴) ۰/۵ µl میکرومولار) از پرایمر اختصاصی ژن
بتاگلوبینGH20 (5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGTAC 3′)، PC04 (5′ CAA CTT CAT CCA (CGT TCA CC3’، ۵۰ ng از DNAنمونه های استخراج شده، جهت اثبات استخراج DNA از نمونه ها انجام شد. تکثیر DNA با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad PCR System, USA) مطابق برنامه دمایی مرحله دناتوراسیون ابتدایی در ۹۵˚C به مدت ۳ دقیقه، ۴۵ چرخه اتصال پرایمر شامل اعمال دمای ۹۵˚C به مدت ۳۰ ثانیه، دمای ۵۳˚C به مدت ۴۰ ثانیه و دمای ۷۲˚C به مدت ۴۰ ثانیه صورت گرفت و در پایان مرحله گسترش نهایی پرایمر با اعمال دمای ۷۲˚C به مدت ۵ دقیقه انجام گردید. محصولات PCR، پس از رنگ آمیزی با gel red بر روی ژل آگارز ۲٪ در تانک الکتروفورز حاوی بافر (Boric acid, Na EDTA, Deionized WaterTris Base, ) TBE با ولتاژ ۱۰۰V به مدت ۱ ساعت مورد بررسی کیفی قرار گرفتند که نتایج به وسیله دستگاه ژل داک و با اشعه UV مشاهده گردید.

نتایج
کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از هر نمونه با الکتروفورز ژل آگارز ۱٪ و سنجش نانودراپ بررسی شد. میزان جذب نوری ۲۶۰/۲۸۰ توسط کیت Bioneer در محدوده ۰٫۰۶-۱٫۸قرار داشت در حالیکه همین جذب نوری توسط کیت GGE بین ۱٫۸-۲ محاسبه شد. در بررسی غلظت DNA استخراج شده نیز کیت GGE نتایج بهتری داشت، بطوریکه میزان غلظت DNA های استخراج شده بین ۱۲۴-۳۵۰۰ ng/μl برآورد شد در حالیکه غلظت DNA استخراج شده توسط کیت Bioneer بسیار پایینتر بود .(۱٫۰۱-۲۳٫۷۸)
کیفیتDNA استخراج شده با دو کیت مورد نظر در نگاره ۱ و ۲ ارائه شده است. در نگاره ۱، کیفیت DNA استخراج شده با کیت Bioneer و در نگاره ۲، کیفیت DNA استخراج شده با کیت GGE نمایش داده شده است. همانطور که مشاهده میشود DNA استخراج شده با کیت Bioneer از کیفیت مناسبی برخوردار نیست و بسیار شکسته شده و حالت اسمیر دارد

این فقط قسمتی از متن مقاله است . جهت دریافت کل متن مقاله ، لطفا آن را خریداری نمایید
word قابل ویرایش - قیمت 12700 تومان در 10 صفحه
127,000 ریال – خرید و دانلود
سایر مقالات موجود در این موضوع
دیدگاه خود را مطرح فرمایید . وظیفه ماست که به سوالات شما پاسخ دهیم

پاسخ دیدگاه شما ایمیل خواهد شد